dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座

dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第1頁(yè)DNA復(fù)制是一個(gè)由各種酶催化和有各種蛋白質(zhì)參加受到精密調(diào)控過(guò)程；

§3-1DNA復(fù)制概貌DNA是細(xì)胞中唯一具修復(fù)系統(tǒng)生物大分子。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第2頁(yè)1958年Meselson和Stahl研究了經(jīng)15N標(biāo)識(shí)幾代大腸桿菌DNA，首次證實(shí)了DNA復(fù)制半保留性。

一、DNA復(fù)制半保留性(Semiconservativereplication)

dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第3頁(yè)二、DNA半不連續(xù)復(fù)制DNAsynthesisissemidiscontinuousdna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第4頁(yè)（一）起點(diǎn)（原點(diǎn)origin）三、復(fù)制起點(diǎn)、方向（即次序性及復(fù)制單位）

replicationorigin&directiondna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第5頁(yè)許多試驗(yàn)證實(shí)，DNA復(fù)制是由固定起始點(diǎn)開始。E.coli染色體復(fù)制原點(diǎn)oriC成串排列3個(gè)13bp重復(fù)序列(GATCTNTTNTTTT)反向重復(fù)出現(xiàn)4個(gè)9bp序列(TTATCCACA)dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第6頁(yè)復(fù)制子（replicon）普通把生物體獨(dú)立復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個(gè)復(fù)制子只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。即能開啟DNA復(fù)制開始基因組上DNA次序，包含復(fù)制原點(diǎn)和引發(fā)復(fù)制結(jié)構(gòu)基因，以及在其控制下DNA區(qū)段統(tǒng)稱為復(fù)制子。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第7頁(yè)5’OHTCApppOHCTCA

C5’

OH3’+ppi（二）子鏈DNA延伸方向

新鏈合成只能從5’

到3’

方向dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第8頁(yè)不一樣細(xì)胞復(fù)制參數(shù)

原核生物（大腸桿菌）真核生物（人）細(xì)胞內(nèi)復(fù)制子數(shù)目（個(gè)）1（1）多個(gè)（103～104）復(fù)制子平均長(zhǎng)度（kb）3～9×106約105～106復(fù)制方向多為雙向多為雙向復(fù)制速度(bp/s/復(fù)制叉)等速（850）等速（60～90）dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第9頁(yè)§3-2DNA復(fù)制酶和相關(guān)蛋白一、DNA聚合酶DNAPolymerase特點(diǎn)：1.以4種dNTP為底物；2.反應(yīng)需要接收模板指導(dǎo)；3.反應(yīng)需要有3’-OH存在；4.DNA鏈合成方向?yàn)?’3’；5.產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第10頁(yè)dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第11頁(yè)(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一個(gè)多功效酶。包含：5’3’聚合酶活性。3’5’核酸外切酶活性。5’3’核酸外切酶活性。從3′端將DNA鏈水解，DNA校對(duì)（proofreading）功效。從5′端將DNA鏈水解，DNA修復(fù)功效。將dNTP加到DNA鏈3′-OH上，DNA聚合功效。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第12頁(yè)dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第13頁(yè)klenow片斷：用枯草桿菌蛋白酶處理能夠?qū)NA聚合酶I水解為一大一小兩個(gè)片段。較大C末端片斷分子量為68KD，叫klenow片斷，含有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，常見做體外合成DNA工具酶。切口平移：DNA聚合酶I5′→3′核酸外切酶活性從5′端切除DNA受損傷部位，DNA聚合酶I5′→3′聚合酶活性隨即開始工作，使DNA鏈向3′端延伸，這稱為切口平移（nicktranslation）。在DNA復(fù)制中，RNA引物切除；DNA損傷修復(fù)；在體外，制備高放射性活性DNA探針。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第14頁(yè)(二)DNA聚合酶Ⅲ

多亞基不對(duì)稱二聚體結(jié)構(gòu)(10種亞基)

1.α亞基、ε亞基和θ亞基相連組成關(guān)鍵酶（coreenzyme）α亞基含有5′→3′聚合酶活性.ε亞基含有3′→5′外切酶活性.

θ亞基可能起組建作用.dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第15頁(yè)2.DNA聚合酶Ⅲ含有連續(xù)合成能力.β亞基功效如同夾子:提升了酶連續(xù)合成能力.

夾子裝置器（clamploader）:兩個(gè)γ亞基與另4個(gè)亞基（δ亞基、δ′亞基、χ亞基、ψ亞基）組成γ復(fù)合物，其主要功效時(shí)幫助β亞基夾住DNA，故稱夾子裝置器。γ亞基是一個(gè)依賴于DNAATP酶

τ亞基起促使關(guān)鍵酶二聚化作用

dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第16頁(yè)二、DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAGyrase)DNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個(gè)負(fù)超螺旋,可去除解螺旋產(chǎn)生扭曲張力.并依賴于β亞基催化ATP水解,以使酶構(gòu)象復(fù)原.DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制細(xì)菌合成.dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第17頁(yè)三、DNA解旋酶(DNAHelicase)和單鏈結(jié)合蛋白(Single-strandDNAbindingprotein,SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解取得能量打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動(dòng)一類酶總稱。預(yù)防核酸水解酶作用

防止解開單鏈DNA重新締合形成雙鏈對(duì)單鏈DNA有很高親和性

它們與DNA結(jié)合時(shí)有協(xié)同作用2.單鏈結(jié)合蛋白（SSB）：dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第18頁(yè)

RNA聚合酶

[RifS]完成對(duì)先導(dǎo)鏈引物合成

實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活起始引發(fā)酶

[RifR]

完成對(duì)后隨鏈引物合成

較先導(dǎo)鏈開啟落后一個(gè)Okazaki片斷

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII進(jìn)行DNA鏈延伸

四、引發(fā)酶(Primerase)dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第19頁(yè)酶-AMP將腺苷?；ˋMP）轉(zhuǎn)移給DNA切口處5′磷?；鶊F(tuán)，以焦磷酸形式活化，形成AMP-P-DNA。五、連接酶(Ligase)DNA連接酶催化雙股鏈內(nèi)相鄰單鏈切口3′-OH與5′-P酰基形成磷酸酯鍵。酶活化經(jīng)過(guò)相鄰DNA3′-OH對(duì)活化P原子進(jìn)行親核攻擊，生成3′，5′-磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出AMP。

催化過(guò)程：

腺苷?；疍NA親核攻擊完成DNA連接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），與酶活性中心賴氨酸殘基ε-NH2以磷酰胺鍵結(jié)合，形成共價(jià)中間體酶-AMP；

。

dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第20頁(yè)§3-3DNA復(fù)制過(guò)程一、E.coliDNA復(fù)制（環(huán)型雙股DNA，雙向θ方式）分為三個(gè)階段：起始、延伸和終止復(fù)制體（Replisome）：在DNA合成生長(zhǎng)點(diǎn)，即復(fù)制叉上，分布著各種各樣與復(fù)制相關(guān)酶和蛋白質(zhì)因子，它們組成復(fù)合物稱為復(fù)制體。DNA復(fù)制階段表現(xiàn)在于復(fù)制體結(jié)構(gòu)改變。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第21頁(yè)dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第22頁(yè)2.復(fù)制終止1.環(huán)行E.coli染色體上兩個(gè)復(fù)制叉相遇在排列有許多重復(fù)拷貝Ter序列（長(zhǎng)約22bp）一個(gè)終止區(qū)域（terminus），并停頓復(fù)制。2.稱為Tus(terminusutilizatlconsubstance，終點(diǎn)利用物質(zhì)）蛋白質(zhì)結(jié)合于Ter序列，Tus_—Ter復(fù)合物只能夠阻止一個(gè)方向復(fù)制叉。3.E.coli分開連鎖體需要拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ（屬于類型Ⅱtopo酶）參加作用。分開兩閉合環(huán)。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第23頁(yè)二、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication）ΦX174基因組DNA是單鏈環(huán)型DNA，復(fù)制中首先合成其互補(bǔ)鏈（而非其本身），形成復(fù)制型（replicationform,RF），然后進(jìn)行滾環(huán)型（roollingcircle）復(fù)制。滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂親本鏈3‘_OH上不停地發(fā)生DNA聚合物作用，因而也叫共價(jià)延伸（covalenceelongation

）。

dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第24頁(yè)三、D環(huán)復(fù)制（displacement

replication）線粒體DNA雙股鏈分為輕鏈和重鏈。它復(fù)制是一個(gè)單向不對(duì)稱特殊復(fù)制方式,稱為Ｄ—環(huán)復(fù)制。復(fù)制從重鏈（Ｈ鏈）原點(diǎn)開始，新合成Ｈ鏈置換原來(lái)鏈，游離單鏈稱為取代鏈（displacement）或Ｄ環(huán)。當(dāng)Ｈ鏈合成進(jìn)行到約2/3時(shí)，輕鏈（Ｌ鏈）原點(diǎn)暴露出來(lái)，并引發(fā)其合成，延伸方向與Ｈ鏈相反。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第25頁(yè)四、真核生物復(fù)制特點(diǎn)（一）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制相同點(diǎn)。（二）真核生物DNA復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制不一樣點(diǎn)：１．真核DNA有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)；2．真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前不能再重新開始復(fù)制，而在快速生長(zhǎng)原核生物中起點(diǎn)能夠連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。3．真核生物復(fù)制調(diào)控遠(yuǎn)比原核生物更為復(fù)雜。4．真核生物有各種聚合酶。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第26頁(yè)從哺乳動(dòng)物中分出５種DNApol酶。分別為polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亞基）：有引物合成酶活性。含有合成RNA后4~5dNTP活性。無(wú)外切酶活性。連續(xù)性中等，約為100核苷酸，完成滯后鏈DNA復(fù)制。Polδ（2亞基）：有連續(xù)合成DNA鏈能力，有3'—5'核酸外切酶活性（含有校正功效），完成前導(dǎo)鏈DNA復(fù)制。

Polε（>1亞基）：相當(dāng)于E.colipolⅠ，是一個(gè)修復(fù)酶，含有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亞基）：與損傷修復(fù)相關(guān)。Polγ（2亞基）：是線粒體DNA合成酶（3'→5'外切酶）

dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第27頁(yè)五、真核生物端粒復(fù)制dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第28頁(yè)●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCC

AACCCC5’(richCchain)

G鏈

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C鏈--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶(tolomerase)催化過(guò)程dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第29頁(yè)七、DNA復(fù)制忠實(shí)性1.DNA復(fù)制是按堿基互補(bǔ)配正確標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2.DNA聚合酶本身含有校正功效。

5.DNA錯(cuò)配校正和修復(fù)系統(tǒng)確保DNA復(fù)制忠實(shí)性。3.RNA引物存在與去除有利于降低錯(cuò)配率。

4.DNA聚合酶催化反應(yīng)機(jī)制，即DNA聚合酶僅催化5'→3'方向反應(yīng)。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第30頁(yè)§3-4DNA損傷及修復(fù)一、DNA損傷DNA損傷是指正常DNA分子化學(xué)結(jié)構(gòu)或物理結(jié)構(gòu)在一些物理、化學(xué)原因（如射線和化學(xué)試劑）以及細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生基因毒素等干擾作用下發(fā)生改變現(xiàn)象。（P221）（一）物理原因如電離輻射：使鏈斷裂、堿基及五碳糖損傷。紫外照射（254nm）：使DNA分子相鄰2個(gè)T形成二聚體（環(huán)丁基二聚體）；（二）化學(xué)原因1.烷基化

2.亞硝基

3.堿基類似物4.吖啶類分子，如EBdna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第31頁(yè)（三）自發(fā)性損傷1.脫嘌呤和脫嘧啶(AP位點(diǎn)產(chǎn)生)2.堿基脫氨基作用3.堿基互變異構(gòu)4.細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物對(duì)DNA損傷dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第32頁(yè)二、DNA損傷修復(fù)（一）錯(cuò)配修復(fù)1.模板區(qū)分機(jī)制催化酶：Dam甲基化酶發(fā)生時(shí)制：DNA復(fù)制后一段時(shí)間內(nèi)（約幾秒或幾分鐘）發(fā)生部位：GATC中腺嘌呤N6位置均能夠發(fā)生甲基化。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第33頁(yè)2.修復(fù)位點(diǎn)識(shí)別MutS結(jié)合在錯(cuò)配位點(diǎn)，MutH結(jié)合于GATC次序；MutL能夠與MutS形成復(fù)合物，并與MutH結(jié)合，在錯(cuò)配堿基兩邊DNA鏈沿著復(fù)合物移動(dòng)是等速，穿過(guò)MutL—MutS復(fù)合物產(chǎn)生一個(gè)DNA環(huán)，直到復(fù)合物碰上甲基化GATC次序。MutH催化切斷GATC次序G堿基5‘一邊未甲基化鏈，給該修復(fù)鏈作上記號(hào)。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第34頁(yè)3.修復(fù)切割與聚合(1)當(dāng)錯(cuò)配點(diǎn)在切點(diǎn)5'端時(shí)，去甲基化以3'→5'方向降解（從切點(diǎn)→錯(cuò)配點(diǎn)）。這個(gè)過(guò)程要有：

DNA解螺旋酶Ⅱ、SSB、

-外切酶Ⅰ或Ⅹ（由3‘→5’方向降解）、DNA聚合酶Ⅲ、DNA連接酶。

(2)錯(cuò)配點(diǎn)在切點(diǎn)3'端一邊時(shí)，修復(fù)路徑類似。外切酶Ⅶ（5'→3'或3'→5'方向降解）、或RecJ蛋白（5'→3'方向降解單鏈DNA）。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第35頁(yè)（二）切除修復(fù)（excisionrepair）

1.堿基切割修復(fù)（baseexcisionrepair）（1）由細(xì)胞內(nèi)一類特異DNA糖苷酶（glycosylase）識(shí)別DNA中不正常堿基，并將其水解下來(lái)，形成AP位點(diǎn)。

（2）AP核酸內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)附近將DNA鏈切開。（不一樣AP核酸內(nèi)切酶作用方式不一樣，或是在5'側(cè)切開，或是在3'側(cè)切開）。

（3）核酸外切酶將包含AP位點(diǎn)在內(nèi)DNA鏈切除。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA鏈3'端延伸以填補(bǔ)空缺，DNA連接酶將連上。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第36頁(yè)AP位點(diǎn)產(chǎn)生dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第37頁(yè)2.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excisionrepair）切除酶（excinuclease）也是一個(gè)核酸內(nèi)切酶，但與普通核酸內(nèi)切酶不一樣，在鏈損傷兩側(cè)同時(shí)切開。編碼此酶基因是Uvr基因。大腸桿菌中ABC切除酶催化過(guò)程：①UvrA和UvrB復(fù)合物（A2B）尋找并結(jié)合到損傷部位。②UvrA離解，UvrB與DNA牢靠結(jié)合。③UvrC蛋白結(jié)合到UvrB，UvrB切開損傷部位3'端第5個(gè)磷酸二酯鍵，UvrC切開5'側(cè)第8個(gè)磷酸二酯鍵。④UvrD解螺旋酶幫助除去。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)。dna復(fù)制和損傷醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第38頁(yè)（三）直接修復(fù)（directrepair）

直接修復(fù)是指不需要移去任何堿基或核苷酸就能夠?qū)p傷逆轉(zhuǎn)到正常狀態(tài)修復(fù)機(jī)制。（P229）1.光復(fù)活修復(fù)（potoreactivationrepair）

2.O6—甲基鳥嘌呤修復(fù)光復(fù)活(photoreactivation)是在可見光(300～600nm)活化之下，光復(fù)活酶(photoreactivatingenzyme，PR)，或稱光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧