本科畢業(yè)設(shè)計-不同ph對豬精液常溫保存效果分析

不同pH對豬精液常溫保存效果分析PAGEPAGE192014屆本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）題目：不同pH對豬精液常溫保存效果分析學(xué)院(系)：動物科技學(xué)院專業(yè)年級：動科102班學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：合作指導(dǎo)教師：完成日期：目錄文獻綜述 3第一章豬精液常溫保存研究進展 31.1豬精液常溫保存研究進展 41.1.1常溫保存的方法 41.1.2豬精液常溫保存的意義 41.2影響豬精液常溫保存的因素 51.2.1保存溫度對豬精液保存效果的影響 51.2.2pH對豬精液保存效果的影響 61.2.3抗菌素對豬精液保存效果的影響 61.3豬精液品質(zhì)評定指標 71.3.1精子活率 71.3.2精子頂體完整率 81.3.3精子質(zhì)膜完整率 8試驗研究 9第二章pH對豬精液常溫保存效果研究 92.1.材料與方法 102.1.1試驗動物和采精時間 102.1.2采精方法 102.1.3試驗儀器 102.1.4精液處理 102.1.5精液品質(zhì)檢查方法 102.1.6稀釋劑配方 112.1.7精液保存 122.1.8數(shù)據(jù)處理 122.2結(jié)果與分析 122.2.1不同保存時間精子活率的變化 122.2.2不同保存時間精液pH的變化 132.3討論 132.3.1稀釋粉對豬精子活力的影響 132.3.2稀釋粉對豬精液保存過程中pH的影響 142.3.3稀釋精液pH對精子活率的影響 142.4結(jié)論 14參考文獻 15致謝 17不同pH對豬精液常溫保存效果分析作者：朱園園指導(dǎo)老師：胡建宏教授（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）摘要：豬精液常溫保存技術(shù)隨著人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用日益顯現(xiàn)出其重要性。在常溫保存過程中pH對于豬精液的質(zhì)量影響比較大。本試驗選取自配稀釋粉Modena和BTS，通過對比2種稀釋液保存后精子的活力、有效保存時間、pH，證明當稀釋精液pH處于7.0～7.3之間的穩(wěn)定狀態(tài)時，精子活率高于0.6，此時稀釋精液可以用于人工授精。當稀釋精液pH呈酸性時，精子活率迅速下降到0.6以下顯著低于pH穩(wěn)定狀態(tài)（p<0.05）。當稀釋精液pH大于7.3時精子活率逐漸下降，在之后2d時間內(nèi)精子活率顯著低于pH穩(wěn)定狀態(tài)（p<0.05）。關(guān)鍵字：豬人工授精；常溫保存；pH；精子活力AnalysisofdifferentpHeffectsonporcinesemenstoredatroomtemperatureAbstract:Pigsemenstoredatroomtemperaturetechnologyaswidelyusedartificialinseminationtechnologyisincreasinglyshowingitsimportance.pHduringstorageatroomtemperatureforboarsemenqualityimpactisrelativelylarge.WhenthistestwithdilutedpowderselectedfromModenaandBTS,bycomparingthetwokindsofdynamicdilutionpreservationofsperm,effectivelysavingtime,pH,provedthatwhensemenpH7.0to7.3inasteadystatebetweentherateofspermmotility0.6,thendilutedsemencanbeusedforartificialinsemination.WhenthepHisacidicsemen,spermmotilitydecreasedrapidlytopH0.6wassignificantlylowerthanthesteadystate(p<0.05).WhenthepHisgreaterthan7.3semenspermmotilitydecreasedgraduallyafter2dtimeinspermmotilitywassignificantlylowerthanthepHsteadystate(p<0.05).Keywords:SwineArtificialInsemination:storageatroomtemperature:pH:spermmotility文獻綜述第一章豬精液常溫保存研究進展隨著我國經(jīng)濟的飛速發(fā)展，人們的生活水平日益提高，使得人們對于物質(zhì)的需求也越來越高，特別是在飲食方面對于肉類的需求和質(zhì)量有了更高的要求。而在我國的肉類消費中豬肉占到70%的比例[1]，為了適應(yīng)市場的需求，養(yǎng)豬業(yè)一方面要擴大規(guī)模，另一方面要加速豬種的改良和豬的繁殖性能。在這種情況向，豬人工授精技術(shù)得到進一步的發(fā)展與應(yīng)用。與傳統(tǒng)的自由交配相比較，人工授精可以提高優(yōu)良公豬的利用率，減少公豬的飼養(yǎng)頭數(shù)，克服本交時體格懸殊的障礙，避免疫病的傳播，特別是在規(guī)?；s化養(yǎng)豬場，采用人工授精是提高經(jīng)濟效益的一項重要措施。隨著人工授精技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，人們開始對豬精液保存技術(shù)進行深入的研究。隨著精液保存技術(shù)的發(fā)展，豬人工授精技術(shù)將會得到更廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在的豬精液保存方法基本上可以分為常溫保存（15～25℃），低溫保存（0～5℃）和冷凍保存（-79～-196℃）三類[2]。目前應(yīng)用豬冷凍精液進行人工授精后，母豬的受胎率低，且冷凍操作程序復(fù)雜，實際生產(chǎn)中存在很多問題，而低溫保存技術(shù)也不甚成熟。因此，豬的人工授精主要采用常溫保存的精液，而稀釋液是影響常溫保存精液效果的關(guān)鍵因素。豬精液常溫保存稀釋劑配制的稀釋液可以為精子提供代謝所需的能量物質(zhì)、適當?shù)膒H和滲透壓環(huán)境，以保證精子在體外具有較強的抗逆性及結(jié)構(gòu)功能的完整性，延長豬精子存活時間、保持其受精能力。1.1豬精液常溫保存研究進展精液常溫保存的定義與冷凍精液和低溫精液相對應(yīng)，國家頒布實施的《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)》標準中對豬常溫精液做出了明確規(guī)定，建立了以保存溫度命名精液產(chǎn)品的規(guī)則，明確了豬精液稀釋劑產(chǎn)品的分類標準。常溫精液是指豬原精液經(jīng)稀釋處理后在16～18℃下短期保存，并具有受精能力的精液。1.1.1常溫保存的方法采集并檢查合格的原精液在溫室下進行稀釋。精液采集后應(yīng)盡快稀釋，原精貯存不能超過30min[3]。稀釋操作時要求精液與稀釋液的溫度不能超過1℃，并且只能通過調(diào)節(jié)稀釋液的溫度使精液與稀釋液的溫度盡可能的接近。稀釋時，將適量的稀釋液緩慢的加入到精液中，然后輕輕搖動或用消毒的玻璃棒攪拌，使兩者輕柔混勻。稀釋后的精液需要緩慢降溫到16～18℃，然后在此溫度下保存。精液應(yīng)在排出空氣的密閉容器中避光保存，減少與氧氣接觸，抑制精子的代謝，延長精液的保存時間。以上操作均為防止環(huán)境變化過于突然導(dǎo)致精子休克死亡或活力下降。1.1.2豬精液常溫保存的意義我國的養(yǎng)豬業(yè)正在從傳統(tǒng)的散戶型向集約化、規(guī)?；I(yè)化方向發(fā)展。養(yǎng)豬業(yè)是關(guān)系到我國人民的生活水平，影響我國經(jīng)濟發(fā)展的全局，發(fā)展好養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)，對于促進我國經(jīng)濟發(fā)展、維護社會和諧穩(wěn)定具有重要的意義。而人工授精技術(shù)的應(yīng)用使養(yǎng)豬生產(chǎn)者降低成本，提高效益，加速品種改良的進程，克服地域限制，在很大的范圍內(nèi)實現(xiàn)資源共享，并且在一定程度上避免了疫病發(fā)生[4]。而豬精液稀釋保存是提高人工授精技術(shù)的首要環(huán)節(jié)，所以豬精液常溫保存對于推動豬人工授精技術(shù)的發(fā)展具有重大意義。1.2影響豬精液常溫保存的因素目前在豬人工授精技術(shù)應(yīng)用中，精液的常溫保存技術(shù)是影響受精效果的關(guān)鍵因素。在我國豬的人工授精技術(shù)經(jīng)過數(shù)年的推廣，已得到了廣泛的使用，普及率達到85%以上。隨著該項技術(shù)的廣泛應(yīng)用，家畜精液的保存技術(shù)也發(fā)展起來，并在繁殖控制和現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中日益顯出重要作用。精液保存技術(shù)是通過降低或抑制精子的新陳代謝強度從而達到延長精子在體外存活時間的一項技術(shù)。豬精液的保存不像牛精液保存技術(shù)那么成熟，豬精子的生理特點決定了豬精液對低溫耐受性不強，對15℃以下溫度敏感。因此經(jīng)過大量的實踐證明，常溫保存更有利于豬精液的保存，且保存條件要求低，操作簡單，輸精后受胎率高，更適合在養(yǎng)殖場和基層改良站開展生產(chǎn)。國際上對豬精液液態(tài)常溫保存也十分重視，多年來，各國研究者對影響精液保存效果的諸多因素進行了廣泛而深入的研究，已經(jīng)基本能確定影響豬精液常溫保存效果的因素包括：溫度、pH、緩沖體系、抗菌素、滲透壓、精子膜結(jié)構(gòu)和延長精液貯存時間的添加物等[5]。常溫精液保存時，一方面可以通過控制環(huán)境溫度、稀釋液的pH和滲透壓來抑制精子的活動，使精子處于可逆的靜止狀態(tài)來延長精液的保存時間；另一方面，通過向稀釋液中添加抗菌素來抑制精液中細菌的活動和繁殖，降低有害細菌對精子的傷害。1.2.1保存溫度對豬精液保存效果的影響哺乳動物精液在較低溫度保存時可有效降低精子能耗和有害代謝物生成，抑制精液內(nèi)細菌的活動，延長精液的保存時間，提高精液的保存效果。但是豬精子對低溫很敏感，當豬精液保存溫度低于15℃時，可能導(dǎo)致豬精子發(fā)生冷休克，造成精子活力下降和頂體完整性受損。這可能與豬精子質(zhì)膜中包含高濃度不飽和脂肪酸有關(guān)。此過程中，精子細胞膜中不同脂類在不同溫度發(fā)生由液相到膠相的相變、分離，使膜流動性下降，蛋白質(zhì)運動和組裝受阻，選擇通透性喪失，胞內(nèi)離子和酶外流，膜上酶活性下降，膜通道調(diào)節(jié)失控。豬精子質(zhì)膜磷脂酰膽堿含量較低，磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂含量較高，膽固醇分布不對稱，在質(zhì)膜外側(cè)較多，而且膽固醇與磷脂比率顯著低于其它哺乳動物精子[6]，這些因素使豬精子對低溫特別敏感。稀釋前的豬精液在室溫下放置數(shù)小時，精子則能對冷休克產(chǎn)生一定程度的耐受，對于延長保存時間、保證精子活率和頂體完整是必要的,其機理尚不清楚[7]。經(jīng)長期研究，人們逐漸確立15～20℃為常溫保存的適宜溫度。5℃和25℃條件下保存的精液活力和頂體完整率下降速度均比15℃條件下要快。豬新鮮精液在15℃和20℃保存48h后其頂體完整率和存活率比4℃和39℃結(jié)果好。鮮紅[8]等在稀釋液配方篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，豬常溫精液的適宜保存溫度為14～18℃，溫度低于14℃或超過20℃則會降低精液的存活時間。康文彪[9]等在篩選稀釋液配方的試驗中發(fā)現(xiàn)，15～18℃條件下保存精液的效果最好。因此，15～18℃在現(xiàn)階段被認為是比較理想的保存溫度。1.2.2pH對豬精液保存效果的影響豬精液常溫保存是利用一定范圍的酸性環(huán)境抑制精子活動，在弱酸性條件下精子代謝和活動力均減弱，從而延長豬精子在體外的存活時間。精子在一定的pH區(qū)域內(nèi)其活性被可逆性抑制，一旦恢復(fù)到pH7.0左右仍然可以恢復(fù)活性，但如果超出一定的酸性范圍，會造成精子死亡[10]。為了確定豬常溫保存稀釋液保存精液的最佳pH，在不同pH條件下保存精液的結(jié)果顯示出在其他條件相同時，pH為6.5～6.9時的保存效果明顯好于pH為6.0～6.4為的保存效果。為了檢驗保存效果進行精子頂體染色的結(jié)果也顯示，在常溫保存條件下，稀釋豬精液原液后控制pH為6.5～6.9，保存3d后精子的頂體完整率超過96%，并且保存的精子具有較高的受精能力[20]。1.2.3抗菌素對豬精液保存效果的影響豬的精液富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，葡糖糖、牛血清蛋白（BSA）、各種微量元素都是微生物繁殖代謝的重要C源、N源和能量物質(zhì)，稀釋液中的這些物質(zhì)極利于微生物的生長繁殖。而且在常溫保存條件下，微生物繁殖速度幾乎不受影響。為了有效抑制微生物對精子的殺傷作用，在精液稀釋液中加入抗微生物藥物，是抑制微生物的繁殖，延長精液保存時間，提高受胎率，從而在實際生產(chǎn)中推動豬人工授精技術(shù)的普及的有效措施。480IU/mL的慶大霉素和400IU/mL的恩諾沙星對精液的保存效果較好，高于或低于這個濃度都不利于精子的保存。濃度過高，可能增加對精子本身的毒害作用，而濃度過低則達不到抑菌效果。宋先忱等[11]的研究顯示，豬精液常溫保存時，當使用不同抗菌藥物時，精液的保存效果不一致，其中慶大霉素與恩諾沙星保存效果最好。由于在豬精液的采集和處理過程中，不可避免地會發(fā)生不同程度的微生物污染。若精液被細菌污染，其保存效果則因細菌的種類和數(shù)量不同而異，并且指出大腸桿菌等對精液保存影響極大，可在短時間內(nèi)使精子活力、頂體完整率、pH大幅度下降[12]。通常情況下，人們采用青霉素作為精液稀釋液的抗菌添加物，雖然青霉素對革蘭氏陽性菌的抗菌效果較好，但對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌卻沒有良好的抑菌作用。而大量試驗證明慶大霉素與恩諾沙星對精液的保存效果優(yōu)于青霉素等，具有藥效穩(wěn)定、迅速滅菌、無毒等優(yōu)點，能直接作用于病原體的細胞核，阻斷DNA復(fù)制的旋轉(zhuǎn)酶，破壞細胞核酸合成，迅速殺滅病原體，對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌、霉形體、支原體等均有強大的殺滅作用。1.3豬精液品質(zhì)評定指標1.3.1精子活率精子的活率和運動能力是與精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性緊密相關(guān)的，并且可以對精子潛在的受精能力作出推測。精子的運動功能是在精子細胞形成精子的過程建立。精子運動能力的健全是在附睪中進行的，但沒有形態(tài)結(jié)構(gòu)上的任何變化。附睪頭精子表現(xiàn)震動不等或雜亂無序的擺動。附睪中段擺動幅度和靈活性較低，但少量精子可以快速向前運動。到附睪尾大部分精子都能呈螺旋式向前運動。當精子排出體外，精液逐漸液化，在30-60min內(nèi)，精子的活動迅速增加[13]。精液中群體精子有三種變化趨勢：活動上升趨勢；活動平緩下降；活動能力迅速消失。為此，這種變化趨勢的差異，就成為精液進行實踐存活率分析的依據(jù)。精子的運動產(chǎn)生于尾部的鞭毛，而為精子提供ATP的部位主要是在頸部中段的線粒體鞘。精子內(nèi)ATP的濃度就決定了精子尾拍擊的頻率。外周致密纖維對鞭毛向前運動器輔助和調(diào)節(jié)作用。所以說，精子運動必須獲能，而中部螺旋狀的線粒體，是提供精子尾部運動的必要能量來源，如果說中部線粒體缺失或受損，將使精子運動遲緩或失去運動能力。為此，在不活動的精子就要考慮其精子的線粒體受損和能量的來源問題。精子運動功能的健全是在附睪內(nèi)進行的，而這一成熟過程中沒有發(fā)現(xiàn)任何精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。而精子的運動是精子許多功能的一種綜合和直觀的表現(xiàn)。雖然目前已經(jīng)認識到精子的運動能力并不直接反映其受精的能力，如無頭精子反而運動速度快。所以，正常精子受精能力的丟失可能早于運動能力的丟失；缺陷精子和不具備受精能力的精子，也可表現(xiàn)為正常的運動。但不管怎樣，正常的精子運動是在生理狀態(tài)下，是完成授精過程的基礎(chǔ)。正常的授精過程需要有正常的或好的精子功能和正常的精子結(jié)構(gòu)，而精子許多不同的功能狀況以及結(jié)構(gòu)的變化，可以通過精子運動的不同改變而加以體現(xiàn)。這是我們認識精子運動功能的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。精子的運動包括兩方面內(nèi)容：精子運動的活力和運動的方式。精子運動動力學(xué)認為：精子的運動活力主要反映在精子頭頸中段部，因為頸中段有豐富的線粒體，作為能量來源；而精子運動方式，則主要表現(xiàn)在精子鞭毛的擺動形式，及因此產(chǎn)生的精子直線或非直線運動，其獨立的運動功能，依賴于正常的鞭毛結(jié)構(gòu)與ATP的存在。對精子運動的檢測和分析，其資料的精確性、豐富性和綜合性，一方面取決于觀察和研究的重點和需要，而更重要的一方面是取決于觀察分析技術(shù)的質(zhì)量和準確。1.3.2精子頂體完整率頂體在精子受精過程中起著重要的作用。因為它能夠釋放蛋白質(zhì)分解酶消化卵丘細胞之間的黏合基質(zhì)，使精子能過通過卵的被膜進行受精。由于頂體結(jié)構(gòu)的畸形，可導(dǎo)致受精率降低或者不受精。精子老化或損傷，會引起頂體帽破壞，先是頂體脊部變化。最后整個頂體消失，頂體完整率和不返情率之間比精子活率與不返情率之間相關(guān)性更強。因此，檢查精子頂體完整率很重要。精子穿過卵子透明帶以前要發(fā)生頂體反應(yīng)，掌握發(fā)生頂體反應(yīng)時頂體結(jié)構(gòu)變化，有助于我們進一步了解受精過程，從而找到提高受胎率的方法。但精子只有具備完整的頂體才能發(fā)生頂體反應(yīng)，從而穿過透明帶[14]。頂體反應(yīng)是精子獲能后的必然結(jié)果，一般包括包裹精子頭部的質(zhì)膜、頂體外膜融合和破裂，釋放內(nèi)含物的過程。這一反應(yīng)是精子與卵子融合必然經(jīng)歷的反應(yīng)之一。精子獲能的一般過程為：精子頭部的質(zhì)膜從赤道段的前部變得疏松，隨后是質(zhì)膜和頂體外膜發(fā)生融合，并形成許多泡狀結(jié)構(gòu)，最后由頂體膜和頂體基質(zhì)釋放出頂體酶系，主要是透明質(zhì)酸酶和頂體素。根據(jù)精子頂體完整和損傷與否，可以將頂體形態(tài)分為4種類型：1.頂體完整型：精子頭部外形正常，著色均勻，頂體完整，邊緣整齊，可見微隆起的頂體嵴，赤道帶清晰。2.頂體膨脹型：頂體輕微膨脹，邊緣不整齊，頂體嵴腫脹，核前細胞不明顯或缺失。3.頂體破損型：頂體破損，精子質(zhì)膜嚴重膨脹破損，著色錢且不均勻，頭前部邊緣不整齊。4.頂體全脫型：精子頂體全部脫落，精子核裸露。1.3.3精子質(zhì)膜完整率精子能夠成功與卵子受精需要具備功能良好的質(zhì)膜，精子質(zhì)膜上含有豐富的多聚不飽和脂肪酸及多種蛋白成分，精子的新陳代謝、活力的維持、獲能、頂體反應(yīng)以及精卵結(jié)合等都需要與精子質(zhì)膜功能完整性密切相關(guān)[15]。因此，精子質(zhì)膜功能可能是評估精液質(zhì)量的重要指標，其檢測技術(shù)的研究已受到越來越來多的重視。精子質(zhì)膜組分對精子質(zhì)量具有非常重要的作用，質(zhì)膜功能良好更是精子發(fā)揮一些特定功能的必要前提。作為一種半滲透屏障，精子質(zhì)膜維持和調(diào)節(jié)胞內(nèi)成分，質(zhì)膜破損會導(dǎo)致精子內(nèi)環(huán)境失衡，最終精子死亡?，F(xiàn)在發(fā)展了一下檢測精子質(zhì)膜功能的方法。精子尾部低滲腫脹試驗精子在低滲溶液中，必須重新建立內(nèi)外液之間的平衡，水分子通過質(zhì)膜進入精子，使精子體積增大而膨脹，這是活精子質(zhì)膜功能正常的標志。由于質(zhì)膜的腫脹是精子尾部發(fā)生彎曲，這種變化在顯微鏡下很容易觀察到，而質(zhì)膜功能不全的精子表現(xiàn)為不膨脹。所以發(fā)生腫脹的精子數(shù)越多，證明精子質(zhì)膜無損傷，精子功能良好[16]。這個試驗簡單、迅速，可作為體外精子質(zhì)膜功能良好的指標，預(yù)測精子潛在的受精能力。伊紅Y水試驗顯微鏡直接觀測法容易將缺乏活力的精子認為是死精子，伊紅Y水試驗利用伊紅Y水染料能使死精子著色的原理來提高區(qū)分精子存活率的準確性。死亡的精子因質(zhì)膜通透性改變可以使伊紅Y染料透過精子質(zhì)膜，精子質(zhì)膜內(nèi)帶陽離子的物質(zhì)可與帶陰離子的酸性伊紅Y染料結(jié)合被染成紅色[17]。顯微鏡下觀察活精子不著色，胞質(zhì)透明，死精子著紅色。伊紅Y水試驗除可檢測精子尾部腫脹率來反映質(zhì)膜功能外，還可以通過檢測精子頭部未著色率來評估精子頭部質(zhì)膜功能。試驗研究第二章pH對豬精液常溫保存效果研究豬人工授精的成敗在很大程度上取決于精液的質(zhì)量。由于豬精子對低溫比較敏感，冷凍保存精液的效果較差，因此在豬人工授精中主要使用常溫保存精液。而常溫保存稀釋液的pH對于豬精液的影響比較大。為了提高人工授精的效果和普及人工授精技術(shù)，對于豬精液的常溫保存提出了更高的要求。所以通過研究pH對于精液活率的影響和精子的生理活動來提高精液的常溫保存技術(shù)，從而提高豬人工授精的效果。本試驗選取自配稀釋液Modena和BTS，通過對比2種稀釋液保存后精子的活力、有效保存時間、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，來分析精子在保存時間的生理活動以及用自配的不同的pH（5.75，6.00，6.25，6.50，6.75，7.00，7.25）稀釋液進行常溫保存，對精子的活力、畸形率，精子的有效存活時間，總存活時間進行分析。2.1.材料與方法2.1.1試驗動物和采精時間楊凌區(qū)養(yǎng)豬服務(wù)站，按常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)管理，20月齡健康杜洛克、大約克和長白種公豬各6頭。2.1.2采精方法手握法采精。采精員首先洗凈、消毒、擦干手掌，然后將手握成空拳，于公豬陰莖伸出同時，導(dǎo)入空拳拳內(nèi)，讓其抽送轉(zhuǎn)動片刻，再用手緊握陰莖龜頭螺旋部分，隨陰莖充分勃起時順勢牽伸向前，不讓滑脫，有節(jié)奏的一緊一松的施加彈性刺激，直至引起公豬射精。公豬射精時，另一只手持帶有過濾紗布的保溫集精杯收集富含精子部分的精液，公豬射精停止，可按上述方法再次施加壓力，即可引起公豬再次射精，直到公豬射精結(jié)束，自動從臺畜上下來為止。試驗期間控制采精頻率，隔天進行一次。2.1.3試驗儀器超純水儀、電子分析天平、恒溫加熱板、顯微鏡、水浴鍋、恒溫箱、保溫箱等。2.1.4精液處理采得的豬精液用四層脫脂紗布過濾，除去膠狀物，同時檢查原精的品質(zhì)。2.1.5精液品質(zhì)檢查方法精子活率按直線運動的精子數(shù)占視野中精子總數(shù)的百分率，具體操作步驟：（1）從保溫箱中取出精液，緩慢搖勻，保證離心管中精液均勻沒有沉淀。（2）在顯微鏡上放置恒溫板，保持37~38℃。（3）在顯微鏡下觀察10個不同視野，在每個視野中分別記錄20個精子的運動狀況，記錄呈直線運動精子的數(shù)。（4）計算直線前進運動精子的百分率，即精子活率：精子活率=直線運動的精子數(shù)/總精子數(shù)×100%精子存活時間從精液稀釋完成開始計算，到稀釋精液活率下降到0.6的時間。精子頂體完整率對精子進行頂體染色，在顯微鏡下觀察頂體完整精子的比例。具體操作步驟：（1）制片：將精液滴于載玻片一端，用另一個載玻片推片，要求薄而均勻，風干5min。（2）固定：用滴管吸固定液，使載玻片一端稍抬高，將固定液緩緩向下流，直到鋪滿整個載玻片，然后平放靜止15min后，將固定液棄去，用流水沖洗后，涼干。（3）染色及觀察：用姬姆薩液染色90min后將染色液棄去，流水沖洗后待自然干燥，干后制成標本。完全干燥后直接用400倍顯微鏡觀察，精子頂體呈紫色包圍精子頭前部，檢查五個不同視野，觀察200個精子中頂體異常數(shù)，計算出精子頂體完整率。（4）計算：頂體異常率=頂體異常精子數(shù)/所計精子數(shù)×100%頂體完整率=1-頂體異常率精子質(zhì)膜完整率精子尾部低滲腫脹試驗(hypo—osmoticswellingtest，HOST)，在顯微鏡下觀察腫脹彎尾的精子比例。具體操作步驟：（1）配制低滲溶液：取用果糖1.351g，二水檸檬酸鈉0.735g，加雙蒸水定容至1L，4℃保存?zhèn)溆?。?）檢測：取用稀釋液稀釋后的精液0.1mL加入1mL低滲液，37℃恒溫水浴30min，取一滴混合液于載玻片上，在400倍顯微鏡下觀察200個精子，計算精子尾部出現(xiàn)膨脹的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例。（1）質(zhì)膜完整率的計算：質(zhì)膜完整率=彎尾精子數(shù)/全部精子數(shù)×100%2.1.6稀釋劑配方Modena與BTS的基礎(chǔ)配方如下表1。表1豬精液常溫保存稀釋液配方Table1Compositionofdifferentextendersusedforliquidstorageofboarsemen配方Component稀釋液成分（g/ml)Extendercomposition無水葡萄糖Anhydrousglucose檸檬酸三鈉TrisodiumcitrateEDTA·2Na碳酸氫鈉Sodiumbicarbonate氯化鉀Potassimchloride檸檬酸CitricacidTrisModena27.56.902.351.000.752.905.65BTS37.156.005——2.1.7精液保存將稀釋精液置于17℃恒溫箱中保存。精液稀釋后立即進行分裝，從恒溫箱中取出精液分瓶裝，分裝瓶的溫度差不高于0.5℃。精液分裝后不宜將精液立即放入17℃保溫箱中保存，讓精液在溫室25℃緩慢降溫后，再將其放入保溫箱。每組試驗測定精液pH，鏡檢活力達到0.7以上者供稀釋保存用；對同頭次所采精液分成7等份，分別按試驗方案作7種稀釋處理，稀釋后在20～25℃恒溫保存；按每24h的時間檢查1次精子活力，直至全部精子死亡，同時檢測精子的畸形率，記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。2.1.8數(shù)據(jù)處理試驗過程中，每個水平設(shè)置2個重復(fù)（本試驗設(shè)2個重復(fù)受公豬一次射精量限制），使用單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標準差表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進行分析。2.2結(jié)果與分析2.2.1不同保存時間精子活率的變化表2不同保存時間精子活率的變化Table2Spermmotilityindifferenttimeduringstorageperiods保存時間/dConservationTime原精Beforedilute稀釋后Afterdilute12345Modena0.867±0.006a0.843±0.012a0.807±0.015b0.783±0.015b0.747±0.012c0.703±0.015d0.630±0.020eBTS0.867±0.007a0.804±0.019a0.727±0.043b0.691±0.024b0.613±0.028c0.573±0.105d-注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），相同字母表示差異不顯著（P>0.05）。由表2知，到5d時Modena稀釋液中精子平均活率為0.63高于4d時BTS稀釋液中精子平均活率0.57。精液保存時間小于5d時，Modena稀釋液保存精子活率顯著高于BTS稀釋液（P<0.05）。2.2.2不同保存時間精液pH的變化表2不同保存時間精液pH的變化Table2SpermpHindifferenttimeduringstorageperiods保存時間/dConservationTime原精Beforedilute稀釋后Afterdilute12345Modena7.01±0.473a7.35±0.700c7.29±0.115b7.24±0.100b7.35±0.379c7.42±0.100c7.49±0.569dBTS7.01±0.474b7.24±0.149c7.15±0.451c7.13±0.237c7.02±0.258b6.84±0.091a-注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），相同字母表示差異不顯著（P>0.05）。由表2知，Modena和BTS稀釋粉稀釋精液后pH顯著增加，這可能與稀釋粉本身pH呈弱堿性有關(guān)。其中，Modena稀釋粉保存精液隨著保存時間的延長，pH不斷升高，這可能是因為Modena稀釋粉中添加了多種緩沖物質(zhì)。BTS稀釋粉保存精液隨著保存時間的延長，pH不斷下降，這可能與精子自身代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)沉積有關(guān)。2.3討論2.3.1稀釋粉對豬精子活力的影響影響精液常溫保存時間和精子活力的因素很多，主要有溫度、稀釋液的緩沖能力、組分等[18]，在同一溫度下保存精液，稀釋粉的組分對保存效果起著決定性作用[19]。本試驗中精子所需要的能量主要由無水葡萄糖提供。蔡元等[20]通過在稀釋液中添加葡萄糖的用量以調(diào)節(jié)稀釋液的滲透壓，維持精子活率。高建明等[21]在豬精液常溫研究中也得到類似結(jié)果，表明5%～7%的葡萄糖溶液有利于豬精子的有效保存。過酸過堿的環(huán)境都不利于精子生存，該稀釋粉中添加有一定量的檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉和Tris等緩沖物質(zhì)以維持精液pH相對穩(wěn)定[22]。碳酸氫鈉或檸檬酸三鈉常被用來調(diào)節(jié)稀釋液pH，但Tris的緩沖能力更強[23]。2.3.2稀釋粉對豬精液保存過程中pH的影響新鮮精液的pH在7.2～7.5之間，當pH低于這個范圍時，精子的運動性和新陳代謝都逐漸降低[24]。大多數(shù)稀釋粉中高濃度的葡萄糖能使精子細胞內(nèi)的pH降至6.0以下，這種酸性環(huán)境可以延長精子的體外保存時間[25]。但如果稀釋液的pH超出一定的酸性范圍，容易引起精子死亡，因此稀釋液中應(yīng)添加適量的緩沖劑以維持pH[]。在弱酸性條件下，稀釋粉的pH為6.5～6.9時保存效果明顯好于pH為6.0～6.4與5.5～5.9的保存效果。戈新[26]等通過測定了26種商品稀釋液的pH表明，稀釋液pH都在6.36～7.26之間，且大多數(shù)的稀釋液的pH呈弱堿性。陳大芳[27]研究得出稀釋液pH在6.5左右保存效果較好，高飛[27]等也得出稀釋液pH在6.0～6.5之間，稀釋后精液pH在6.5～7.0之間，對延長精子壽命具有顯著效果[28]。本試驗測定在有效保存時間內(nèi)，稀釋精液pH在6.80～7.50之間，也是中性偏弱堿性，這可能是因為弱堿性的稀釋液對精子造成的應(yīng)激更小，也符合精子的生存環(huán)境[29]，且弱堿性的稀釋液在精液保存的過程中可以中和精子和細菌的酸性代謝產(chǎn)物，從而有利于精液保存。通過分析不同稀釋液對豬精液常溫保存效果的影響發(fā)現(xiàn)，也得到弱堿性稀釋液有利于精液的常溫保存的相同結(jié)論。2.3.3稀釋精液pH對精子活率的影響研究豬精液常溫保存稀釋粉的pH有重要的意義，因為稀釋粉一方面要維持精液穩(wěn)定的pH環(huán)境，避免因精子自身氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的酸性物質(zhì)沉積而影響整個稀釋液的穩(wěn)定環(huán)境，對精子造成損傷[30]。另一方面，張寶殉[31]的研究認為稀釋精液處于弱堿性環(huán)境時，會抑制精子的活動使精子處于可逆性的休眠狀態(tài)，從而延長精液的保存時間。本試驗結(jié)果表明，當稀釋精液pH處于7.0～7.3之間的穩(wěn)定狀態(tài)時，精子活率高于0.6，此時稀釋精液可以用于人工授精。當稀釋精液pH呈酸性時，精子活率迅速下降到0.6以下顯著低于pH穩(wěn)定狀態(tài)（p<0.05）。當稀釋精液pH大于7.3時精子活率逐漸下降，在之后2d時間內(nèi)精子活率顯著低于pH穩(wěn)定狀態(tài)（p<0.05）。這與孫曉軍[32]的研究結(jié)果相同，說明保存精液的適宜pH范圍在7.0～7.3之間。當稀釋精液pH超出此范圍，精子活率下降到0.6以下，無法用于人工授精。因此，保證稀釋精液pH的穩(wěn)定狀態(tài)，對于延長精液有效保存時間意義重大。2.4結(jié)論本實驗結(jié)果表明，當稀釋精液pH處于7.0～7.3之間的穩(wěn)定狀態(tài)時，精子活率高于0.6，此時稀釋精液可以用于人工授精。當稀釋精液pH超出此范圍，精子活率下降到0.6以下，無法用于人工授精。稀釋粉配方中調(diào)節(jié)稀釋液pH的有檸檬酸、檸檬酸三鈉和碳酸氫鈉，維持稀釋精液穩(wěn)定的緩沖物質(zhì)有EDTA和Tris。通過稀釋粉配方的研究，配制一種可以保持稀釋精液pH穩(wěn)定狀態(tài)的豬精液常溫保存稀釋粉，對于人工授精技術(shù)應(yīng)用中延長精液有效保存時間有重要意義。參考文獻[1]施學(xué)仕．豬人工授精新技術(shù)簡述．豬業(yè)科學(xué)，2007，(5)：43[2]呂學(xué)斌，龔建軍，應(yīng)三成，等公豬精液長效稀釋液配方研究．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000，(z1)

[3]侯麗鵬.不同稀釋液對豬精液常溫保存效果的影響[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.[4]何蘭花．周美華，陸少華，等．豬精液常溫保存的試驗黑龍江動物繁殖，2005，(4)：8～9

[5]張菊仙．豬人II：授精的實驗室操作規(guī)程．云南農(nóng)業(yè)，2007[6]張守全.美國豬人工授精技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀及啟示[J].黑龍江動物繁殖,1998,6(2):41-44.[7]金從福,保國,郭仁龍,等.豬人工授精的發(fā)展與優(yōu)點[J].畜禽業(yè),2010,(259):55.[8]鮮紅，鄭鴻培豬精液常溫保存稀釋液配方篩選試驗．畜禽業(yè)。

2004，(1)：56～57

[9]康文彪.概述豬人工授精工作的進展和現(xiàn)狀[M].中國畜牧雜志,1992,28（5）：57-58[10]覃燦,封桂甲.一種簡單實用的豬精液常溫保存稀釋液在容縣的推廣應(yīng)用[J].廣西畜牧獸醫(yī),1994,2(2):28-29.[11]宋先忱.去精清對提高遼寧絨山羊細管凍精質(zhì)量的影響[C].//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）,中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會,2004.[12]蔡元,潘紅梅,王金勇,等.豬精液常溫保存效果的研究[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2005(5):2-4
[13]周歧生,陸增康.公豬精液液態(tài)低溫保存試驗[J].畜牧與獸醫(yī),1986(4):151-153
[14]石輯.豬人工授精中精液處理技術(shù)[J].農(nóng)村實用技術(shù)與信息,1995(9):21-22.[15]DeLeeuwFE,ColenbranderB,VerkleijAJ.Therolemembranedamageplaysincoldshockandfreezinginjury[J].ReprodDomestAnim,1990,Suppl1:95-104.[16]JohnsonLA,WeitzeKF,FiserP,etal.Storageofboarsemen[J].AnimReprodSci,2000,62(1-3):143-172.[17]鮮紅,鄭宏培.豬精液常溫保存稀釋液配方篩選試驗[J].國外畜牧學(xué)-豬與禽,2004,24(3):4-6.[18]GadeaJ.Semenextendersusedintheartificialinseminationofswine[J].SpanJAgricRes,2003,1(2):17-27.[19]張忠誠.家畜繁殖學(xué)[M].4版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:71-73.[20]蔡元,潘紅梅,王金勇等.豬精液常溫保存效果的研究[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2005(5):2-4．[21]高建明,虞桂平,邵世義等不同稀釋液對豬精液常