基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座

第19章基因診療GeneDiagnosis基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第1頁人類疾病原因內(nèi)因：基因結(jié)構(gòu)改變（基因突變）——點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因擴(kuò)增

基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性

基因表示異常外因：

病原體侵入基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第2頁對(duì)于疾病診療依據(jù)：臨床表現(xiàn)試驗(yàn)室診療技術(shù)：

細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)生物化學(xué)代謝產(chǎn)物和酶活性改變檢驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)

基因診療基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第3頁細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)細(xì)胞膜血清學(xué)診療基因診斷生化學(xué)診療臨床學(xué)診療臨

床表現(xiàn)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第4頁一、基因診療概述(一)基因診療概念與特點(diǎn)(二)基因診療基本原理與臨床意義基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第5頁(一)基因診療概念與特點(diǎn)1．概念：

指利用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA或RNA水平檢測(cè)基因存在、分析基因結(jié)構(gòu)變異和表示狀態(tài)，對(duì)疾病作出診療方法和過程?；蛟\療以DNA和RNA為診療材料，

DNA診療RNA診療基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第6頁2．基因診療特點(diǎn)：（1）直接檢測(cè)基因，屬病因診療，針對(duì)性強(qiáng)；（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高：因?yàn)榛蛟\療采取核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（3）適用范圍廣：其應(yīng)用范圍已從原先局限遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域?；蛟\療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第7頁(二)基因診療基本原理與臨床意義1．基本原理：

經(jīng)過檢測(cè)致病基因（包含內(nèi)源基因與外源基因）存在、量多少，結(jié)構(gòu)改變是否及表示水平是否正常，以確定被檢驗(yàn)者是否存在基因水平異常改變，以此作為疾病確診依據(jù)。2．臨床意義:

對(duì)有表型出現(xiàn)疾病作出明確診療

早期快速診療

確定個(gè)體對(duì)疾病易感性疾病分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等

基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第8頁二、基因診療慣用技術(shù)與方法(一)基因診療慣用技術(shù)(二)基因診療基本方法基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第9頁(一)基因診療慣用技術(shù)1.核酸分子雜交2.PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）3.限制性酶切分析4.SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）5.DNA測(cè)序6.DNA芯片技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第10頁1.核酸分子雜交

Southernblot——DNANorthernblot——RNADotblotInSituHybridization,

基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第11頁核酸分子雜交流程示意圖待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參加雜交探針檢測(cè)雜交信號(hào)制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)識(shí)核酸探針基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第12頁探針種類DNA

探針:基因組DNA探針;基因探針cDNA探針:當(dāng)前應(yīng)用最廣泛寡核苷酸探針(Oligonucleotideprobes)RNA

探針:基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第13頁

不一樣探針在應(yīng)用中有各自特點(diǎn),但最主要是探針序列選擇.而探針序列又是依據(jù)待測(cè)核酸序列選擇。

對(duì)致病性微生物應(yīng)選取其最保守、最特異序列；對(duì)突變基因檢測(cè)，應(yīng)用含有突變位點(diǎn)序列或待測(cè)基因編碼ｍＲＮＡ序列?；蛟\療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第14頁探針標(biāo)識(shí)物放射性標(biāo)識(shí)物32P，35S，125I，3H非放射性標(biāo)識(shí)物生物素，地高辛，熒光素，酶，金屬基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第15頁SouthernblotNNTTNTT基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第16頁1、Southernblot：用于DNA檢測(cè)，不但能檢測(cè)出特異DNA片段，還能進(jìn)行定位和測(cè)定分子量，可用于基因限制性內(nèi)切酶圖譜分析、基因突變分析等。2、Northernblot：雜交用于RNA檢測(cè)，能對(duì)組織細(xì)胞中總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析。3、dotblot：既可檢測(cè)DNA也或檢測(cè)RNA，用于基因組中特定基因及其表示定性和定量分析。缺點(diǎn)：特異性較低，不能判定所分析基因分子量。4、原位雜交：在組織、細(xì)胞和染色體水平作核酸定性和定量分析，并可定位?；蛟\療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第17頁P(yáng)CR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段合成過程（二）PCR技術(shù)是基因診療一個(gè)基礎(chǔ)技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第18頁P(yáng)CR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率基因擴(kuò)增技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第19頁聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR多重PCR：多對(duì)PCR引物同時(shí)進(jìn)行PCRPCR/SSCPPCR/ASO基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第20頁1、直接采取PCR技術(shù)進(jìn)行基因診療

經(jīng)過PCR技術(shù)擴(kuò)增特異性基因，能夠確定病原生物基因是否存在或分析疾病相關(guān)體內(nèi)基因缺失或基因突變

基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第21頁2、采取PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）

PCR－RFLP就是利用PCR技術(shù)先將包含待測(cè)位點(diǎn)DNA片段擴(kuò)增出來，然后用識(shí)別該位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶水解，依據(jù)限制性片段數(shù)量和長(zhǎng)度作出診療?；蛟\療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第22頁3、采取PCR-ASO技術(shù)等位基因特異性寡核苷酸探針技術(shù)（ASO）原理：針對(duì)已知突變位點(diǎn)基因，能夠分別針對(duì)已知突變位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與無突變序列互補(bǔ)，另一個(gè)為突變型探針，與突變序列互補(bǔ)。同時(shí)設(shè)計(jì)探針時(shí)，突變堿基應(yīng)位于探針中央，這么在嚴(yán)格控制雜交和洗脫條件下，只有完全互補(bǔ)探針保留下來，形成穩(wěn)定雜交分子，而中央堿基與靶序列不匹配探針則被洗脫。基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第23頁

已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)識(shí)，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。

NormalβΑGeneProbe——與正常

ProbeβΑ雜交穩(wěn)定

MutationβSGeneProbe——與異常

βS雜交穩(wěn)定

PCR-ASO技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第24頁等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第25頁斑點(diǎn)雜交結(jié)果：

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

突變型遺傳病直接基因診療正常探針突變探針基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第26頁4、PCR產(chǎn)物反相點(diǎn)雜交分析技術(shù)

此項(xiàng)技術(shù)與PCR/ASO技術(shù)原理完全相同，只是雜交時(shí)采取是反相雜交。是將探針固定在膜上成為固定相，用PCR產(chǎn)物作為液體相，進(jìn)行雜交試驗(yàn)?；蛟\療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第27頁

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析是一個(gè)基于單鏈DNA構(gòu)象差異來檢測(cè)點(diǎn)突變方法。DNA經(jīng)變性形成單鏈后，在中性條件下單鏈DNA會(huì)因其分子內(nèi)堿基之間相互作用，形成一定立體構(gòu)象。相同長(zhǎng)度單鏈DNA會(huì)因分子內(nèi)堿基組成或排列次序不一樣，形成構(gòu)象就不一樣，這么就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。對(duì)長(zhǎng)度相同而構(gòu)象不一樣單鏈DNA在非變性聚丙烯胺凝膠電泳中表現(xiàn)出不一樣遷移率。

5、采取PCR產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析進(jìn)行基因診療

(PCR-SSCP)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第28頁

PCR-SSCP技術(shù)就是利用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，經(jīng)過變性成為單鏈，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸改變會(huì)造成DNA片段構(gòu)象改變，其遷移率也會(huì)改變，從而檢測(cè)基因突變?；蛟\療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第29頁基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第30頁

該技術(shù)是先制備濃度從低到高變性劑凝膠，然后將待測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，到DNA電泳到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性位置時(shí)，DNA雙鏈分開，因?yàn)椴灰粯覦NA片段堿基組成不一樣，所以在凝膠中泳動(dòng)發(fā)生變性位置不一樣，遷移率也不一樣，所以能夠?qū)⑾嗤L(zhǎng)度但堿基組成不一樣DNA片段分開，從而能檢測(cè)出基因突變。6、采取PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第31頁

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)主要組成部分，在維持正常細(xì)胞功效、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著主要作用，是當(dāng)前新研究熱點(diǎn)之一。如在普通正常細(xì)胞中，基因調(diào)控區(qū)CPG島處于非甲基化狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變后，這些區(qū)域往往展現(xiàn)甲基化狀態(tài)。所以DNA甲基化研究是一熱點(diǎn)。7、甲基化特異性PCR技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第32頁

將DNA先用亞硫酸鹽處理，這么未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ谆蛔?，隨即行引物特異性PCR。在MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)為甲基化特異性引物（primerⅠ），一對(duì)為非甲基化引物（primerⅡ），進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只有結(jié)合完全甲基化或非甲基化特異性引物片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，最終能夠確定研究DNA片段部位甲基化情況。甲基化特異性PCR技術(shù)（MS-PCR）基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第33頁基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第34頁以上介紹基于PCR擴(kuò)增技術(shù)建立基因診療技術(shù)，只能提供定性結(jié)果，即有沒有突變。但對(duì)基因表示異常疾病，上述方法無法滿足需要，還需要研究其基因表示量上改變分析，故還可利用PCR定量分析基因表示。PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀釋法、極限稀釋法、非競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法、

熒光定量PCR8、采取PCR技術(shù)進(jìn)行靶核酸定量分析基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第35頁P(yáng)CR擴(kuò)增有限性-平臺(tái)期及平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）PCR擴(kuò)增平臺(tái)效應(yīng)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第36頁梯度（系列）稀釋法：在擴(kuò)增檢測(cè)待測(cè)樣本同時(shí)，擴(kuò)增一系列稀釋已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）假如在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物/模板成線性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)樣本中PCR模板相對(duì)量

必須在擴(kuò)增指數(shù)期進(jìn)行

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，可作粗糙定量分析。缺點(diǎn)：不準(zhǔn)確，影響原因多。

基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第37頁首先將原始模板進(jìn)行梯度稀釋;然后對(duì)該稀釋系列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)定;最低陽性樣本被認(rèn)為含有與一已知標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列中最終陽性樣本中相同量PCR模板基本依據(jù)：PCR擴(kuò)增有效起始模板分子數(shù)為104～106個(gè)改良方法：極限稀釋分析基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第38頁基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第39頁非競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照基因定量法

該定量法是靶基因與參考基因同時(shí)擴(kuò)增。即在一樣反應(yīng)條件下，在一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增來自同一DNA一段靶序列和另一段內(nèi)標(biāo)序列(通常是管家基因或它們mRNA)。經(jīng)過比較兩種序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶顏色強(qiáng)度對(duì)靶基因定量。基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第40頁靶基因與參考標(biāo)準(zhǔn)在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，但參考標(biāo)準(zhǔn)通常是一段人工合成模板而不是內(nèi)源性基因。競(jìng)爭(zhēng)PCR必須構(gòu)建一個(gè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，此標(biāo)準(zhǔn)能與靶基因競(jìng)爭(zhēng)聚合酶、核苷酸和引物分子，含有相同引物結(jié)合位點(diǎn)，其擴(kuò)增產(chǎn)物能經(jīng)過電泳或高效液相色譜(HPLC)等方法區(qū)分開來。將競(jìng)爭(zhēng)模板作系列稀釋后，加入到恒量樣品DNA進(jìn)行PCR，經(jīng)過分離和分析競(jìng)爭(zhēng)模板與樣品DNA產(chǎn)量，對(duì)樣品DNA進(jìn)行定量分析。競(jìng)爭(zhēng)性PCR：基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第41頁3.DNA

sequencing

DNA序列測(cè)定是最直接、最準(zhǔn)確基因診療技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第42頁例：四色熒光自動(dòng)測(cè)序分析結(jié)果基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第43頁基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第44頁4.DNA芯片技術(shù)

DNAchipsormicroarray基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第45頁

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量探針以顯微打印方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)識(shí)樣品雜交，經(jīng)過對(duì)雜交檢測(cè)分析，得出樣品遺傳信息（基因序列及表示信息）

因?yàn)樵谥苽溥^程中利用了計(jì)算機(jī)芯片制備技術(shù)如顯微光蝕刻、顯微打印等，且慣用硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)概念基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第46頁DNA芯片技術(shù)原理大規(guī)模集成固相雜交基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)、變性和復(fù)性原理

以大量已知序列寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測(cè)樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后經(jīng)過定性、定量分析得出待測(cè)樣品基因序列及表示信息基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第47頁生物戰(zhàn)劑檢測(cè)臨床疾病基因診療法醫(yī)學(xué)判定藥品研究開發(fā)動(dòng)植物檢疫基因組研究后基因組計(jì)劃生物信息學(xué)DNA芯片DNA芯片技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第48頁第二節(jié)對(duì)不一樣疾病采取不一樣基因診療策略

人類疾病各種多樣，致病原因不一樣，所以在基因診療上也有不一樣路徑和策略。

1、對(duì)致病基因已經(jīng)找到、發(fā)生機(jī)制清楚疾病，能夠經(jīng)過直接檢測(cè)致病基因進(jìn)行基因診療。如：病原微生物感染：病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌等，及與疾病相關(guān)機(jī)體內(nèi)源性基因：癌基因、抑癌基因、病理基因。

基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第49頁2、對(duì)致病基因還沒找到，發(fā)生機(jī)制也沒有完全清楚，但致病基因已定位于染色體或基因組特定區(qū)域疾病，能夠經(jīng)過檢測(cè)致病基因聯(lián)鎖遺傳標(biāo)識(shí)進(jìn)行基因診療。3、對(duì)多原因、多基因疾病，能夠經(jīng)過檢測(cè)表型克隆基因進(jìn)行基因診療。4、對(duì)一些因基因表示異常出現(xiàn)疾病，可經(jīng)過基因表示定量分析進(jìn)行基因診療。對(duì)與基因表示異常出現(xiàn)疾病，能夠在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)該基因表示mRNA量進(jìn)行分析，作出診療。

基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第50頁第三節(jié)基因診療應(yīng)用前景1.雜交基礎(chǔ)上RFLP分析（20世紀(jì)80年代）2.PCR及其衍生技術(shù)3.基因芯片技術(shù)基因診療發(fā)展歷史基因診療醫(yī)學(xué)宣教專家講座第51頁第三節(jié)基因診療應(yīng)用前景1.理論