基因工程原理與技術

基因工程原理與技術基因工程原理與技術第1頁第一章緒論第一節(jié)基因工程概念基因工程(geneengineering)是當代生物技術關鍵內容。

基因工程是在分子水平上進行遺傳操作，是指將一個或各種生物體基因分離出來或人工合成基因，按照大家愿望，進行嚴密設計和體外加工重組，轉移到另一個生物體細胞內，使之能在受體細胞中遺傳表示并取得新遺傳性狀而形成新生物類型生物技術。

基因工程關鍵內容是基因體外重組(DNA體外重組)?；蚬こ趟拇笠?或基礎條件)：目標基因、載體、工具酶、受體。

相關名詞：遺傳工程、基因工程、基因操作、重組DNA技術、分子克隆、基因克隆、基因無性繁殖。基因工程突出特點：打破物種間基因交流界限。

基因工程原理與技術第2頁第二節(jié)基因工程誕生與發(fā)展

基因工程誕生于1973年。一、基因工程誕生理論和技術基礎1、理論基礎

①DNA是遺傳物質；

②DNA分子雙螺旋結構和半保留復制；

③遺傳密碼通用性和遺傳信息傳遞方式。2、技術基礎

①限制性核酸內切酶發(fā)覺與DNA切割；

②DNA連接酶發(fā)覺與DNA片段連接；

③基因工程載體構建與應用。

基因工程原理與技術第3頁二、基因工程誕生

1972年，美國斯坦福大學P.Berg研究小組DNA體外重組試驗。

1973年，斯坦福大學S.Cohen研究小組DNA體外重組和大腸桿菌轉化試驗。(見下兩張幻燈片)

同年，加利福尼亞大學H.Boyer也進行了類似試驗。這一試驗成功標志著基因工程誕生，所以，1973年被定為基因工程誕生元年。

基因工程原理與技術第4頁pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因基因工程原理與技術第5頁培養(yǎng)平皿

卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平板基因工程原理與技術第6頁三、基因工程發(fā)展

分為艱難階段、逐步成熟階段、快速發(fā)展階段、鼎盛發(fā)展階段。1、基因工程艱難階段(1973~1976，載體和受體系統(tǒng)安全性改造)

基因工程安全性問題，造成許多國家限制基因重組試驗。2、基因工程逐步成熟階段(1976~1982，基因工程藥品研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)企業(yè)成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先將人工合成生長激素釋放抑制因子14肽基因重組入質粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽(見下列圖)；

1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表示成功；

1979年美國基因技術企業(yè)用人工合成人胰島素基因重組轉入大腸桿菌中，并經過發(fā)酵生產人胰島素。從而揭開了基因工程產業(yè)化序幕。

基因工程原理與技術第7頁大腸桿菌生長激素釋放抑制因子重組體+SS基因目標基因基因載體從動物腦中提取5mg---50萬只羊腦9升工程大腸桿菌培養(yǎng)液基因工程原理與技術第8頁3、基因工程快速發(fā)展階段(1982~，動植物基因工程育種與基因治療)

發(fā)展了一系列新基因工程操作技術，構建了各種轉化原核生物和動物、植物細胞載體。

1982年首次經過顯微注射培育出世界上第一個轉基因動物——轉基因小鼠。

1983年采取農桿菌介導法培育出世界上第一例轉基因植物——轉基因煙草。

1990年美國政府首次同意一項人體基因治療臨床研究計劃，對一名因腺苷脫氨酶基因缺點而患有重度聯(lián)合免疫缺點癥兒童進行基因治療取得成功。

1991年，美國提出人類基因組計劃并實施?；蚬こ淘砼c技術第9頁4、鼎盛發(fā)展階段(21世紀)

年完成人類基因組計劃。至今，基因工程藥品上市有幾十種，上百種正在進行臨床試驗。

轉基因植物快速發(fā)展，當前最少有150種轉基因植物問世。自從1986年抗除草劑轉基因煙草被首次同意進入田間試驗以來,至今國際上已經有30個國家同意上千例轉基因植物進入田間試驗,包括植物種類達50各種。自從1994年轉基因延熟西紅柿獲準上市以來，當前最少有51種轉基因植物上市。

基因工程原理與技術第10頁

即使轉基因動物比轉基因植物誕生早，但其發(fā)展比轉基因植物要慢得多！主要原因是動物轉基因技術操作煩瑣、困難，動物細胞培養(yǎng)要求高，不易再生出個體。荷蘭GenPharm企業(yè)用轉基因牛生產乳鐵蛋白，預計每年從牛奶生產出來營養(yǎng)奶粉銷售額是50億美元?；蚬こ淘砼c技術第11頁

英國羅斯林研究所研制成功轉基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治療肺氣腫病。這種病在北美比較常見，病人以前只能依賴于注射人α[1]-抗胰蛋白酶做替換療法，價格昂貴，而現(xiàn)在用轉基因羊來生產，每升這種羊奶可售6000美元。基因工程原理與技術第12頁

中國工程院院士曾溢濤教授研究小組取得5只轉基因山羊。其中一只奶山羊乳汁中，含有堪稱血友病人救星藥品蛋白——有活性人凝血因子Ⅸ。

基因工程原理與技術第13頁第三節(jié)基因工程研究主要內容一、基因工程研究主要內容主要包含：基礎研究（載體研究、受體系統(tǒng)研究、目標基因研究、工具酶研究、轉化方法研究、生物基因組學研究）和應用研究等。1、載體研究構建各種用途載體及提升外源基因表示效率。2、受體系統(tǒng)研究

包含細菌、真菌、植物、動物。

受體系統(tǒng)安全性及轉化效率。3、目標基因研究目標基因分離、克隆及改造。

基因工程原理與技術第14頁4、工具酶研究開發(fā)新工具酶。5、轉化方法研究開發(fā)各種受體細胞高效轉化方法。6、生物基因組學研究含有主要經濟價值各種生物基因組測序、挖掘新基因等。7、應用研究

包含基因工程藥品研究、基因疫苗研究、轉基因植物研究、轉基因動物研究以及在酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學與能源工業(yè)及環(huán)境保護等方面應用。

基因工程原理與技術第15頁二、基因工程基礎操作程序

①分離取得帶有目標基因DNA片段及載體選擇與構建。

②限制性核酸內切酶分別切割外源DNA和載體。

③經過DNA連接酶將外源基因DNA片段連接到載體上，形成重組DNA分子。

④將重組DNA分子引入到受體細胞(轉化)。

⑤帶有重組體細胞(轉化體)擴增及選擇培養(yǎng)。

⑥轉化體判定，取得外源基因高效穩(wěn)定表示基因工程菌或細胞。⑦目標基因深入研究分析，并設法使之實現(xiàn)功效蛋白表示(基因功效研究或基因改造研究)。

基因工程原理與技術第16頁基因工程原理與技術第17頁三、基因工程基礎操作內容基因工程主體戰(zhàn)略思想是外源基因穩(wěn)定高效表示。為到達此目標，可從以下幾個方面進行操作。

①選取高拷貝載體，增加外源基因在受體細胞中劑量；②篩選、修飾和重組開啟子、增強子、終止子等基因轉錄調控元件，并將這些元件與外源基因精細拼接，強化外源基因轉錄水平。③選擇、修飾和重組核糖體結合位點及密碼子等mRNA翻譯調控元件，強化受體細胞中蛋白質生物合成過程。

④構建融合表示載體或分泌表示載體，增加外源蛋白可溶性。

基因工程原理與技術第18頁第四節(jié)基因工程意義與發(fā)展前景一、基因工程研究意義①大規(guī)模生產其它生物體內含量極微但卻含有較高經濟價值生物分子；②設計構建新物種(新性狀乃至全新物種

)；③搜尋、分離和判定生物體尤其是人體內遺傳信息資源(基因)。二、基因工程發(fā)展前景基因工程問世以來短短三十年，顯示出了巨大活力，基因工程前景將愈加燦爛輝煌。今后，基因工程重點研究方向是基因組學、基因工程藥品、動植物生物反應器和環(huán)境保護等方面。

基因工程原理與技術第19頁第二章基因工程工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用核酸酶類。依據(jù)其用途分為四類：限制性內切酶、連接酶、聚合酶、修飾酶。第一節(jié)限制性核酸內切酶一、宿主限制-修飾現(xiàn)象(見下列圖)

限制作用(restriction)：指一定類型細菌能夠經過限制酶作用，破壞入侵噬菌體DNA，造成噬菌體寄主幅度受到限制。這是維護宿主遺傳穩(wěn)定保護機制。

修飾作用(modification)：指寄主本身DNA，因為在合成后經過甲基化酶作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭本身限制性酶破壞。這是宿主細胞識別本身遺傳物質和外來遺傳物質作用機制?；蚬こ淘砼c技術第20頁R/M系統(tǒng)①DNA甲基化酶②限制性核酸內切酶R/M系統(tǒng)作用①限制作用②修飾作用基因工程原理與技術第21頁1953年，Arber發(fā)覺限制-修飾現(xiàn)象，預見限制性核酸內切酶存在；

1970年，H.O.Smith從流感嗜血桿菌中分離出第一個II型限制性核酸內切酶HindII。

Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA?；蚬こ淘砼c技術第22頁基因工程原理與技術第23頁

依據(jù)限制-修飾系統(tǒng)遺傳分析，大腸桿菌K12有以下4種表型：①rk+mk+：野生型，含有完整限制和修飾功效。②rk-mk+：限制缺點型，不能降解外源DNA，但含有修飾功效，這類突變株經常見于基因工程受體。③rk-mk-：限制和修飾缺點型，既無限制功效，又無修飾功效，也常見于基因工程受體。④rk+mk-：修飾缺點型，缺乏修飾本身DNA功效，但含有限制功效，故也稱為“自殺性表型”(suicidephenotype)?；蚬こ淘砼c技術第24頁二、限制性核酸內切酶類型

限制性核酸內切酶是指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內或附近特異切割雙鏈DNA核酸內切酶。

簡稱限制性內切酶或限制性酶，當前已經判定出三種不一樣類型。至今，已發(fā)覺近4000種限制酶。特征Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結構功效輔助因子識別序列切割位點切割方式應用價值舉例異源三聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對稱序列距識別序列1kb處隨機性切割無EcoK、EcoB同源三聚體限制Mg2+

4-6bp回文序列識別序列內或附近特異切割廣泛EcoRI、HindIII…異源二聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對稱序列識別序列下游24-26bp處隨機性切割小EcoPI基因工程原理與技術第25頁三、限制性核酸內切酶命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系統(tǒng)，1980年Roberts在此基礎上進行了修改。①限制性核酸內切酶第一個字母(大寫，斜體)代表該酶宿主菌屬名(genus)第一個字母；第二、三個字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)前兩個字母。②第四個字母代表宿主菌菌株名第一個字母(小寫，正體)或染色體外成份(質?；蚴删w，大寫，正體)。③若從一個菌株中發(fā)覺了幾個限制性核酸內切酶，即依據(jù)發(fā)覺和分離先后次序用羅馬字母表示(正體)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ基因工程原理與技術第26頁四、II型限制性核酸內切酶基礎特征1、II型限制性內切酶識別序列

普通為4～6bp回文序列。也有6bp以上，如NotI，稱為稀有切割限制酶。有些為反向重復序列(間斷回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶識別序列中，某一位或二位堿基并非嚴格專一，如HindII可識別4種核苷酸序列。

酶識別序列酶識別序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG基因工程原理與技術第27頁2、II型限制性核酸內切酶切割方式大多數(shù)II型限制性核酸內切酶均在其識別位點內部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位酯鍵，產生3’端為羥基、5’端為磷酸基團片段。有三種切割方式：①在識別序列對稱軸5’末端切割，產生5’黏性末端，如EcoRI基因工程原理與技術第28頁②在識別序列對稱軸3’端切割，則產生3’黏性末端，如PstI基因工程原理與技術第29頁③在識別序列對稱軸上切割，產生平頭末端，如PvuII

有些識別序列為間斷型回文序列II限制酶，其切點位于不確定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC基因工程原理與技術第30頁

有極少數(shù)II型限制性核酸內切酶切割位點遠離識別序列，如MboII識別GAAGA序列，切割位點則是：

5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指識別序列相同、切割方式相同或不一樣、起源不一樣II限制性核酸內切酶。如：HpaII與MspI識別序列和切割位點都相同(C↓CGG)，但MspI還能夠識別已甲基化序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，識別序列相同，但切割位點不一樣?；蚬こ淘砼c技術第31頁

同尾酶是指起源各異、識別序列不一樣，但產生相同黏性末端II限制性核酸內切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸內功酶不含有甲基化功效如EcoRI限制性核酸內切酶與EcoRI甲基化酶，二者均識別GAATTC序列，而前者能對G↓AATTC序列進行切割，后者作用是使第二個A甲基化。當前已經分離到許多II型限制性核酸內切酶與其對應甲基化酶?；蚬こ淘砼c技術第32頁4、II型限制性核酸內切酶對單鏈DNA切割有一些II限制性核酸內切酶，除雙鏈DNA外，還能夠特異識別并切割單鏈DNA對應位點，只是切割效率比較低。如HhaI能切割單鏈噬菌體ФX174和M13mp18DNA，只是切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸內切酶主要用途①產生含有相同粘性末端DNA片段，方便重組克?。虎诮NA分子限制酶圖譜；③構建基因文庫；④構建載體。基因工程原理與技術第33頁六、II型限制性核酸內切酶酶切反應1、標準酶解體系建立

反應體積普通為20μl(依據(jù)DNA量可適當擴充)。

①10×酶切緩沖液

2μl(大個別酶反應緩沖液基礎相同：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(依據(jù)酶活力大小及工作性質確定酶量，不超出反應總體積10％

③DNA樣品(μ

g~mg)④無菌水

限制性核酸內切酶一個活力單位(U)為：在適當溫度和緩沖液中，在20μ

L反應體系中，1h完全降解1ug標準DNA所需要酶量?；蚬こ淘砼c技術第34頁2、酶解反應①混勻②酶解(溫度、時間)③酶解判定④終止a、加EDTA至10mmol/L；

b、加SDS至0.1%(W/V)；

c、65℃水浴保溫20min(有些最適反應溫度較高酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；

d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸內切酶對DNA不完全酶解(見下列圖)

不完全酶解對于構建物理圖譜和基因組文庫是非常必要。其方法有降低酶量、增加反應體積、縮短反應時間和降低反應溫度等。

基因工程原理與技術第35頁incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3基因工程原理與技術第36頁4、Ⅱ限制性核酸內切酶操作注意事項①商品化限制性核酸內切酶均為濃縮液，每次操作時應使用新吸頭去取酶；②加入酶體積應不超出總體積10%，不然酶液中甘油濃度超出5%時將會抑制酶活性；③整個操作應在0℃進行，即在冰浴中進行，而且是在加入其它試劑之后，最終加入酶；④盡可能使反應體積減到最小，即盡可能少加水；⑤當切割大量DNA時，通常采取延長反應時間，降低酶用量；⑥當DNA需2種或以上酶切時，應用通用緩沖液。若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產物，再進行下一個酶切反應?；蚬こ淘砼c技術第37頁七、影響限制性核酸內切酶活性與酶切效果原因

1、酶純度；要求不存在其它核酸內切酶或外切酶污染。

2、DNA樣品純度；

DNA樣品中蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。樣品中DNase會降解DNA，影響酶切。3、酶切反應溫度、時間；多數(shù)II型限制酶最適反應溫度是37℃，但SmaI為25℃或30℃，SfiI為50℃，TaqI為65℃

。反應溫度過高或過低都會影響酶活性，甚至造成酶失活。基因工程原理與技術第38頁4、DNA甲基化程度；限制性核酸內切酶不能切割甲基化核苷酸序列。這一特征有特殊用途：①改變一些限制性核酸內切酶識別序列；②產生新限制酶識別序列；③保護限制性核酸內切酶切點；④利用一些同裂酶對甲基化敏感性不一樣，研究細胞DNA位點專一性甲基化程度和分布。

大腸桿菌中DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。大腸桿菌中DNA胞嘧啶甲基化酶

(dcm)在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影響。采取去甲基化酶大腸桿菌菌株來制備質粒DNA，可預防DNA甲基化?；蚬こ淘砼c技術第39頁5、DNA分子構型

限制性內切酶對不一樣構型DNA分子酶切效果是不一樣，比如超螺旋DNA酶解所需要酶量，比線性DNA酶解所需要酶量高許多，甚至可高達20倍。有些限制性核酸內切酶對于同一DNA分子上不一樣位置識別序列，切割效率顯著不一樣。比如，EcoR

I、HindIII對λDNA酶切。6、反應緩沖液主要成份：pH(Tris-HCl)、離子強度(NaCl)、Mg2+；

輔助成份：β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)預防酶氧化；

牛血清蛋白(BSA)組分V對于一些酶是必需，可預防酶在低濃度蛋白質溶液中變性?；蚬こ淘砼c技術第40頁

星號活性是指在極端非標準反應條件下，限制性核酸內切酶能切割與特異識別序列相同序列特征。

比如EcoRI在高pH(＞8)、低鹽(50mmol/L)和高濃度甘油(＞5％)存在情況下，其識別序列由GAATTC改變?yōu)镹AATTN。以EcoRI

表示其星號活性。

引發(fā)星號活性原因有：①高甘油含量，大于5%；②酶用量過大，大于100U/微克DNA；③低離子強度，小于25mmol/L；④高pH，大于8.0；⑤含有機劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+二價陽離子存在。常發(fā)生星活性內切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等?；蚬こ淘砼c技術第41頁第二節(jié)DNA連接酶

1967年幾個試驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)覺DNA連接酶。一、定義與反應機理

DNA連接酶是指能催化雙鏈DNA分子內或分子間5’-磷酸基和3’-羥基生成磷酸二酯鍵而使DNA鏈連接一類酶。大腸桿菌和其它細菌：NAD+動物細胞和噬菌體：ATP基因工程原理與技術第42頁T4DNA連接酶連接DNA/RNA雜合分子中DNA鏈切口DNA連接酶無連接基因工程原理與技術第43頁DNA連接酶作用機理基因工程原理與技術第44頁二、DNA連接酶種類1、T4噬菌體DNA連接酶(T4DNA連接酶)

T4DNA連接酶DNA/RNARNA

平頭末端Km比黏性末端Km高約1000倍。提升平頭末端連接效率方法：①加大酶濃度(10~100倍于粘性末端)；②加大底物濃度；③加入適量一價陽離子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低濃度PEG(10%PEG8000)。ATP最適終濃度為0.5mmol/L。基因工程原理與技術第45頁2、大腸桿菌DNA連接酶

E.coliDNA連接酶DNA/RNAE.coliDNA連接酶無連接3、T4噬菌體RNA連接酶

用途：RNA末端標識pNpNNNNT4RNA連接酶基因工程原理與技術第46頁三、DNA連接酶反應體系

DNA連接酶活性單位較通用是韋氏(Weiss)單位，一個韋氏單位是指在37℃，20min內催化從γ,β-32P-ATP焦磷酸根置換出1nmol32P所需要酶量。

M-L單位：以d(A-T)n作為底物黏性末端連接單位：以λDNA/HindIII片段為底物一個韋氏單位相當于0.2個M-L單位或者60個黏性末端連接單位。

反應體系：10μL或20μL，DNA片段，連接酶，Buffer，溫度(12~16℃或<30℃)，時間(4~16h)

Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT基因工程原理與技術第47頁四、影響連接反應原因1、DNA末端濃度連接產物分子構型(線形或環(huán)狀)與DNA濃度及DNA分子長度存在親密關系。在一定濃度下，小分子DNA片段進行分子內連接，有利于形成環(huán)化分子。對于長度一定DNA分子，其濃度增加有利于分子間連接。另外，分子間連接還與兩種片段末端濃度百分比相關。標準上一個片段濃度大于另一一個片段濃，如：在克隆中，插入片段:載體片段=2:1。2、反應溫度

介于最適溫度與其Tm之間。＞30℃會造成T4DNA連接酶不穩(wěn)定。

3、ATP濃度

ATP最適終濃度為0.5mmol/L，濃度過高會抑制連接?；蚬こ淘砼c技術第48頁第三節(jié)DNA聚合酶

DNA聚合酶分為：①依賴于DNADNA聚合酶；②依賴于RNADNA聚合酶。常見DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow片段酶、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、逆轉錄酶。酶聚合反應速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性連續(xù)合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速無低低T4DNA聚合酶中速無高低T7DNA聚合酶快速無高高修飾T7DNA聚合酶快速無低或無高TaqDNA聚合酶快速有無高逆轉錄酶低速無無中基因工程原理與技術第49頁一、大腸桿菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：雙鏈DNA帶磷酸基團5’端或

DNA/RNA雜合分子中RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作用DNAPolI基因工程原理與技術第50頁主要用途：切口平移法制備DNA探針反應體系：在25μl反應體系中含有1μg純化特定DNA片斷，并加入適量DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標識dNTPs。

DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs基因工程原理與技術第51頁二、Klenow片段

Klenow酶含有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺失5`→3`核酸外切酶活性。其主要用途以下：①補平限制性核酸內切酶產生5’黏性末端；

基因工程原理與技術第52頁②標識3’凹陷末端DNA分子或平末端；

DNA末端標識普通標識活性不高，極少用于分子雜交探針標識，主要用于DNA序列測定等所需片段標識。

基因工程原理與技術第53頁③合成cDNA第二鏈；④雙脫氧末端終止法測定DNA序列；⑤在單鏈模板上延伸寡核苷酸引物，以合成雜交探針和進行體外突變。

平末端標識基因工程原理與技術第54頁三、T4噬菌體DNA聚合酶

含有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺乏5’→3’外切酶活性。其3’→5’外切酶活性比Klenow酶高100~1000倍。

在無dNTP時，能夠從任何3`-OH端外切(即可降解dsDNA，只是其活性比ssDNA低很多)，在只有一個dNTP時，外切至互補核苷酸，在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位。T4DNA聚合酶置換合成作用無dNTP時，T4DNA聚合酶有dNTP時，T4DNA聚合酶基因工程原理與技術第55頁T4DNA聚合酶用途：①切平核酸內切酶產生3’黏性末端基因工程原理與技術第56頁②末端標識。尤其是不需要核酸外切酶幫助就可進行平末端標識，這種探針標識方法稱為置換(取代)合成法。

置換合成法將產生一組末端完全標識、而從末端到中點其標識量遞減分子。

基因工程原理與技術第57頁四、T7噬菌體DNA聚合酶與測序酶

T7DNA聚合酶含有5`→3`聚合酶活性及很強單鏈、雙鏈DNA3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性。其最大特點是有最強連續(xù)合成能力。其用途以下：

①用于長模板(M13DNA)引物延伸；(不受DNA二級結構影響，聚合能力較強可延伸合成數(shù)千個核苷酸)②經過延伸或取代合成法標識DNA3’末端；

③將雙鏈DNA5’或3’突出末端轉變成平末端結構。對天然T7DNA聚合酶進行修飾，使之降低或完全失去3’→5’外切酶活性，而聚合酶活性增加了3倍。所以，修飾T7DNA聚合酶主要用于雙脫氧測序，又稱作為測序酶。另外，還用于末端標識、探針制備(可催化較低水平<0.1μmol/LdNTP參入)、體外誘變中DNA鏈合成。

基因工程原理與技術第58頁五、TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶含有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。其最大特點是熱穩(wěn)定(95℃以上高溫半小時不失活)，最適反應溫度高(70

75℃)。所以，其主要用途是PCR及DNA測序(含有二級結構DNA)。保真PCR酶有TmaDNA聚合酶(Thermotoamaritima

海棲熱袍菌)、TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis

海棲熱球菌)、PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus

激烈火球菌)、PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesi

沃氏火球菌)?；蚬こ淘砼c技術第59頁六、逆轉錄酶①5’→3’聚合酶活性。逆轉錄酶能以RNA或DNA為模板合成DNA分子，不過后者合成很慢；

基因工程原理與技術第60頁②RNA酶H活性。能從5’或3’方向特異地降解DNA/RNA雜交分子中RNA鏈。

基因工程原理與技術第61頁

商品化逆轉錄酶主要是鳥類骨髓母細胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆轉錄酶和Moloney鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV)逆轉錄酶。

其用途有：

①合成cDNA第一鏈，構建cDNA文庫；②RT-PCR；③以RNA為模板制備DNA探針；④補平和標識5’-末端突出DNA片段；⑤代替Klenow酶用于DNA序列分析?；蚬こ淘砼c技術第62頁第四節(jié)修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉移酶(末端轉移酶)

末端轉移酶能在二價陽離子作用下，催化DNA聚合作用，但不需要模板，將脫氧核糖核苷酸加到DNA分子3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端轉移酶效率高Co2+dATP末端轉移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低基因工程原理與技術第63頁用途：①給載體和外源DNA(如cDNA或隨機切割DNA)接上同聚物尾，方便連接；②末端標識基因工程原理與技術第64頁二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脫氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖核酸酶1、核糖核酸酶A(RNaseA)RNaseA是一個內切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基3’端磷酸酯鍵。其反應條件極寬，且極難失活。在低鹽濃度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割單鏈和雙鏈RNA、DNA/RNA中RNA；當NaCl濃度為300mmol/L或更高時，RNaseA就特異性切割單鏈RNA。

基因工程原理與技術第65頁RNaseA用途:①確定RNA或DNA中單堿基突變位置；②經過RNA雜交技術檢測特定RNA(特異降解單鏈RNA，對雜交雙鏈RNA不起作用)，較northern雜交靈敏；③轉錄起始點及內含子剪接位點分析，其靈敏度比S1核酸酶分析法高數(shù)倍；

④降解DNA樣品中RNA分子。2、核糖核酸酶T1

RNaseT1也是一個內切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上鳥嘌呤殘基3’端磷酸酯鍵。其催化活性與用途類似于RNaseA。基因工程原理與技術第66頁3、核糖核酸酶HRNaseH特異地降解DNA/RNA雜交雙鏈中RNA鏈，產生含有3’-OH和5’-磷酸末端寡核苷酸和單核苷酸，不能降解單鏈或雙鏈DNA或RNA。

其用途是產生cDNA第二鏈合成引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA連接酶基因工程原理與技術第67頁(二)

脫氧核糖核酸酶I

DNaseI是一個內切脫氧核糖核酸酶，可從嘧啶核苷酸5’-端磷酸隨機降解單鏈或雙鏈DNA，生成含有5’-磷酸末端寡核苷酸。Mg2+Mn2+用途：①產生大腸桿菌DNA聚合酶I切口平移切口；②在Mn2+存在下，產生構建基因組文庫大片段DNA；③DNasel足跡法測定DNA結合蛋白在DNA上準確結合位點；④除去RNA樣品中DNA?；蚬こ淘砼c技術第68頁(三)S1核酸酶作用特點：①需要Zn2+和酸性條件(pH4.0~4.5)；②降解單鏈DNA或RNA，但降解DNA速度大于降解RNA速度(7倍)；③降解方式為內切和外切，內切為主；④酶量過大時也可降解雙鏈核酸，為單鏈1/75000。用途：①切掉DNA片段單鏈突出末端產生平頭末端；②在雙鏈cDNA合成時切除發(fā)夾環(huán)結構；③S1核酸酶作圖分析。

如內含子數(shù)目、大小、位置分析及轉錄起始位點與終止位點分析等。

基因工程原理與技術第69頁內含子數(shù)量及大小分析DNAmRNA分子雜交RERES1核酸酶變性凝膠電泳MABM：分子量MarkerA：未經S1酶處理B：經S1酶處理但不能定位內含子基因工程原理與技術第70頁轉錄起始點定位分析RERERE酶切堿性磷酸酯酶多核苷酸激酶**變性后與mRNA雜交*S1核酸酶*變性凝膠電泳MAB基因工程原理與技術第71頁三、核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是一類從多核苷酸鏈末端開始逐一降解核苷酸酶。

單鏈核酸