大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、重組DNA轉(zhuǎn)化、克隆篩選大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第1頁1.試驗?zāi)繕?biāo)和要求經(jīng)過本試驗學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體技術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化概念及其在分子生物學(xué)研究中意義。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第2頁2.相關(guān)知識及原理感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學(xué)試劑法）處理后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，成為能允許多有外源DNA載體分子經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第3頁轉(zhuǎn)化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞取得新遺傳性狀一個伎倆，是基因工程等研究領(lǐng)域基本試驗技術(shù)。

進(jìn)入細(xì)胞DNA分子經(jīng)過復(fù)制表示，才能實現(xiàn)遺傳信息轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用受體細(xì)胞普通是限制－修飾系統(tǒng)缺點變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶突變株。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第4頁轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl）制備感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過高壓脈沖作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第5頁克隆篩選：主要用不一樣抗生素基因篩選。慣用抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第6頁將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后細(xì)胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較輕易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子受體細(xì)胞。不然，假如將轉(zhuǎn)化后菌液涂在無選擇性抗生素培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個克隆含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。即使只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒細(xì)菌才能在含有抗生素平板上生長和繁殖，但對于連接混合物而言，此時并不能確定哪個克隆含有插入片段。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第7頁重組質(zhì)?？寺∨卸ㄅ卸◣в兄亟M質(zhì)粒克隆方法慣用有-互補、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選方法。最慣用方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析，對于帶有LacZ基因載體還能夠結(jié)合-互補現(xiàn)象來篩選。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第8頁-互補現(xiàn)象：因為有些載體都帶有一個LacZ基因調(diào)控序列和頭146個氨基酸編碼信息，編碼-互補肽，該肽段能與宿主編碼缺點型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補（-互補）。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼－半乳糖苷酶C端部分序列宿主細(xì)胞中時，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)下，宿主可同時合成這兩種肽段，即使它們各自都沒有酶活性，但它們能夠融為一體形成含有酶活性蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為

-互補現(xiàn)象。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第9頁由互補產(chǎn)生－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－

－D－半乳糖苷(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色菌落，所以利用這個特點，在載體該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當(dāng)插入一個外源DNA片段時，會造成LacZ(

)基因失活，破壞-互補作用，就不能產(chǎn)生含有活性酶。所以，有重組質(zhì)粒菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒菌落為藍(lán)色。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第10頁大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第11頁重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程示意圖大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第12頁3．儀器、材料和試劑無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心機，移液器，微型離心管等；菌株：E.coliDH5α質(zhì)粒：pBluscriptKS+DNA片段重組質(zhì)粒以及pBluscriptKS空質(zhì)粒；LB培養(yǎng)基；含抗菌素LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度50-100μg／mL，X-gal20-48μg/ml,IPTG100μg/ml。普通將抗生素、X-gal和IPTG配制成1000貯備液，用時按培養(yǎng)基量再加入）；預(yù)冷CaCl2溶液（0.1mol／L）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第13頁4．操作步驟

1）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備(CaCl2法)（1）從新活化E.coliDH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長久。將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時停頓培養(yǎng)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第14頁（2）每組取培養(yǎng)液3個2ml轉(zhuǎn)入2ml離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4℃，4000r／min離心10min（從這一步開始，全部操作均在冰上進(jìn)行，速度盡可能快而穩(wěn)）；（3）倒凈上清培養(yǎng)液，用1ml冰涼0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰??；（4）0～4℃，4000r／min離心10min；（5）棄去上清液，加入500μl冰涼0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞。0～4℃，4000r／min離心10min；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第15頁（6）棄去上清液，加入100μl冰涼0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；（7）制備好感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化試驗，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保留六個月至一年。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第16頁2）細(xì)胞轉(zhuǎn)化

(1)分別取3個100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是冷凍保留液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面操作)，第一組，加入10μl重組質(zhì)粒DNA(體積不超出10μl)+100μl感受態(tài)細(xì)胞，此管為轉(zhuǎn)化試驗組。第二組，插入DNA片段對照組，即酶切后DNA片段25ng+100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液；第三組，質(zhì)粒DNA對照組，即1ng未酶切pBluescript質(zhì)粒DNA十100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第17頁(2)將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后快速冰上冷卻2min(3)馬上向上述管中分別加入0.4mlLB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表示抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第18頁3)平板培養(yǎng)（有時需要稀釋）取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻（假如用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第19頁(2)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未相互重合時停頓培養(yǎng)，對于能夠藍(lán)白斑篩選質(zhì)粒和菌株來說，此時應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落。用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106-2107個轉(zhuǎn)化菌落。在實際工作中，每微克有105以上轉(zhuǎn)化菌落足以滿足普通克隆試驗。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第20頁4)檢出轉(zhuǎn)化體和計算轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中菌落數(shù)，各試驗組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長情況應(yīng)如表所表示:

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞專家講座第21頁組含抗