高考生物一輪復(fù)習(xí)動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體DNA的粗提取與鑒定DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(實(shí)驗(yàn))

第十單元生物技術(shù)與工程第36講

基因工程重組DNA技術(shù)的基本工具01基因工程的基本操作程序02DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(實(shí)驗(yàn))03基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程04目錄考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(實(shí)驗(yàn))03DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色初步分離DNA和蛋白質(zhì)溶解DNA鑒定DNA

利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。（1）實(shí)驗(yàn)原理1、DNA的粗提取與鑒定①取材、研磨稱取約30g切碎的菜花加10mL研磨液充分研磨研磨目的：破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)易溶在研磨液中（2）實(shí)驗(yàn)步驟1、DNA的粗提取與鑒定②過濾獲取含DNA的上清液在漏斗中墊上紗布，將菜花研磨液過濾到燒杯中在4℃冰箱中放置幾分鐘后再取上清液。低溫放置的作用可抑制酶的活性以阻止DNA降解及運(yùn)動，使之易形成沉淀析出。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。DNA會吸附在濾紙上，用紗布減少DNA的損失（2）實(shí)驗(yàn)步驟1、DNA的粗提取與鑒定③冷卻酒精析出DNA上清液加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA的降解；②抑制分子運(yùn)動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。（2）實(shí)驗(yàn)步驟1、DNA的粗提取與鑒定上清液加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液，靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。防止將絲狀DNA攪碎，不利于DNA絮狀物的挑出③冷卻酒精析出DNA（2）實(shí)驗(yàn)步驟1、DNA的粗提取與鑒定取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。1號試管2號試管加入2mol/LNaCl溶液5mL5mL絲狀物(DNA)不加用玻璃棒攪拌無變化加入二苯胺試劑4mL4mL沸水浴5min5min觀察現(xiàn)象不變藍(lán)變藍(lán)加入絲狀物溶解④DNA的鑒定溶液藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關(guān)（2）實(shí)驗(yàn)步驟1、DNA的粗提取與鑒定利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合；PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)；②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制原理（1）實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)2、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定①帶電粒子：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可帶正電荷或負(fù)電荷。②遷移動力與方向：在電場的作用下，帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。③遷移速率：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)。④檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳（1）實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)2、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（2）PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟①用微量移液器按照配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。②待所有的組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在管的底部。2、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定③參照下表參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min預(yù)變性使DNA充分變性以利引物和模板更好結(jié)合（2）PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟2、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定①用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，常配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液，在沸水浴或微波爐熔化，稍冷卻加入適量核酸染料混勻。②將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。（3）DNA的電泳鑒定2、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。④將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。⑤接通電源，根據(jù)電泳槽陰陽極間的距離來設(shè)定電壓(1～5V/cm)。待指示劑前沿移近凝膠邊時停止。⑥取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（3）DNA的電泳鑒定2、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定考法1圍繞DNA的粗提取與鑒定，考查實(shí)驗(yàn)探究能力1．(2022·山東卷)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法錯誤的是(

)A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)BA．圖①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)可溶于酒精B．圖①和圖③都需要用玻璃棒沿一個方向輕緩攪拌，便于DNA的析出并保持結(jié)構(gòu)完整C．豬血不宜選作“DNA的粗提取和鑒定”的實(shí)驗(yàn)材料D．若圖④操作后DNA充分溶解，則NaCl溶液的濃度約為2mol/L考法1圍繞DNA的粗提取與鑒定，考查實(shí)驗(yàn)探究能力2．(不定項(xiàng))下圖是“DNA的粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)中幾個重要操作的示意圖，下列敘述正確的是(

)ACDA．PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B．3號樣品植株導(dǎo)入的目的基因一定能成功表達(dá)C．9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾考法2圍繞DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定，考查科學(xué)探究3．(2022·東營期末)用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(Marker)，2～10號為PCR產(chǎn)物；其中2號的模板為野生型植株DNA,3～9號模板為轉(zhuǎn)基因植株的DNA,10號使用蒸餾水代替模板DNA。PCR時加入的模板DNA如圖注所示。下列據(jù)此得出的分析中，不合理的是(

)B考法2圍繞DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定，考查科學(xué)探究4．下列關(guān)于核酸片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的相關(guān)敘述，正確的是(

)A．PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加ATP，以激活耐高溫的DNA聚合酶B．mRNA也是核酸，因此可直接用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增C．PCR產(chǎn)物常通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定D．瓊脂糖凝膠電泳中的緩沖液中含指示劑，其可以在紫外燈下被檢測出來C作業(yè)1、在基因表達(dá)載體的構(gòu)建中，下列說法不正確的是()①一個基因表達(dá)載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子②有了啟動子才能驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止④所有基因表達(dá)載體的構(gòu)建是完全相同的A．②③B．①④C．①②D．③④2、下列關(guān)于目的基因的檢測與鑒定的敘述，錯誤的是()A．目的基因在真核細(xì)胞中能否穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是目的基因是否插入質(zhì)粒DNA中B．檢測受體細(xì)胞是否含有目的基因及其是否成功轉(zhuǎn)錄可使用PCR等技術(shù)C．目的基因表達(dá)的鑒定通常是在個體水平上進(jìn)行的D．如在受體細(xì)胞內(nèi)檢測到目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，可確定目的基因上游含有啟動子BA3、基因工程中目前最常用的運(yùn)