滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第1頁二、常見滅活劑滅活機(jī)理與應(yīng)用

(一)

滅活劑種類1、甲醛溶液：①蛋白質(zhì)②核酸烷基化（不加中止劑）2、烷化劑

乙?；蚁﹣啺罚ˋEI）二乙烯亞胺(BEI)

縮水甘油醛

（使微生物核酸烷基化,滅活后加2%硫代硫酸鈉中止滅活）3、苯酚（石炭酸）：用于防腐，極少用于疫苗研制4、結(jié)晶紫：蛋白質(zhì)變性。（溶于有機(jī)溶劑）用于診療抗原制備：雞白痢抗原5、β-丙酰內(nèi)酯病毒滅活劑，為狂犬病滅活苗制備所用.

注意：滅活劑對人有害，有時對皮膚粘膜有強(qiáng)烈刺激性如：甲醛、β-丙酰內(nèi)酯滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第2頁甲醛溶液：《規(guī)程》（）中26種滅活疫苗滅活機(jī)理：

滅活濃度：多數(shù)為0.1％～0.3％滅活標(biāo)準(zhǔn)：低濃度、短時間而又能到達(dá)徹底滅活目標(biāo)；必要時可在滅活后加入硫代硫酸鈉，以中止其反應(yīng)。

氨基甲基胺

羧基亞甲基二醇單酯

巰基亞甲基二醇

甲醛醛基

羥基羥基甲酚滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第3頁烷化劑（alkylatingagent）

乙?；蚁﹣啺罚ˋEI)、二乙烯亞胺(BEI)、縮水甘油醛滅活機(jī)制：

1.烷化DNA分子中鳥嘌呤或腺嘌呤等，引發(fā)單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)，因改變DNA結(jié)構(gòu)而破壞其功效，妨礙RNA合成，從而抑制細(xì)胞有絲分裂。

2.與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。優(yōu)點(diǎn)：能破壞病毒核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而不損害其蛋白衣殼，保留其保護(hù)性抗原。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第4頁1、乙?；蚁﹣啺罚∟-acetylethylenimine，AEI）淡黃色澄明液體，有輕微氨臭味，能與水或醇任意混合。0～4℃可保留1年，在-20℃可保留2年AEI功效基團(tuán)是乙烯亞胺基，可用于口蹄疫滅活苗。口蹄疫病毒液:終濃度0.05％，30℃8h,加2％硫代硫酸鈉阻斷2、二乙烯亞胺（binaryethylenimine，BEI）市購商品為0.2％BEI溶液，在0～4℃可保留1個月;終濃度0.02%,加入2％硫代硫酸鈉中止滅活。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第5頁3、縮水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）大腸桿菌、噬菌體、新城疫病毒滅活效果優(yōu)于甲醛。本品易揮發(fā)，水溶液含量為15～31mg/ml。0～4℃3個月含量漸下降，約六個月失效；20℃只能保留10d。

4、-丙酰內(nèi)酯（

－propiolactone）又名羥基丙酸-

-內(nèi)酯無色有刺激氣味液體，水溶液應(yīng)密封于玻璃瓶中5℃保留水中溶解度37％，能與丙酮、醚和氯仿任意混合對皮膚、粘膜及眼有強(qiáng)刺激性，對動物有致癌性。病毒滅活后，能保持良好免疫原性主要用于狂犬病滅活疫苗制備。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第6頁三、影響滅活作用原因1、滅活劑特異性：石炭酸對真菌和病毒效果差，甲醛最常見。2、微生物種類和特征3、滅活劑濃度（一定要適合）4、滅活溫度（詳細(xì)不一樣病原體或毒素，其滅活時間和溫度不一致）5、滅活時間6、滅活PH值7、有機(jī)物存在滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第7頁

第二節(jié)保護(hù)劑（穩(wěn)定劑）保護(hù)劑：又稱穩(wěn)定劑（stabilizer）

，是指一類能預(yù)防生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時受到破壞物質(zhì)。（指對疫苗生產(chǎn)、血清制備等）保護(hù)劑用途（不一樣用途加不一樣保護(hù)劑,主要針對活微生物或細(xì)胞）①菌種或毒種保留：常見甘油作保護(hù)劑②細(xì)胞株保留：常見二甲基亞砜(DMSO)

DMSO:二甲基亞砜，一個細(xì)胞保護(hù)劑

③疫苗冷凍真空干燥制備時：加脫脂乳（或二甲基亞砜）和蔗糖等（不一樣國家有不一樣配方）④干擾素類生物活性物質(zhì)保留：加葡聚糖滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第8頁

保護(hù)劑（protector）分類分類：（依據(jù)其作用機(jī)理）——滲透劑：如二甲基亞砜（DMSO）、甘油和蔗糖等——非滲透劑：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白質(zhì)等（依據(jù)其分子量大?。叻肿游镔|(zhì)、低分子物質(zhì)。（按其化學(xué)性質(zhì)）——復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第9頁

復(fù)合物脫脂乳、明膠、蛋白質(zhì)、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等糖類蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等鹽類乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等醇類山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸類檸檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等一些常見冷凍干燥保護(hù)劑

分類保護(hù)劑滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第10頁

疫苗凍干保護(hù)劑組成1.營養(yǎng)液：可修復(fù)因凍干而受損細(xì)胞，使凍干制品含有一定量水分；可促進(jìn)高分子物質(zhì)形成骨架，使凍干制品呈多孔海綿狀，增加溶解度2.賦形劑：預(yù)防低分子物質(zhì)碳化和氧化，保護(hù)活性物質(zhì)不受加熱影響使凍干制品形成多孔性、疏松海綿狀物，增加溶解度3.抗氧化劑：抑制凍干制品中酶作用，增加生物活性物質(zhì)在凍干后貯存期間穩(wěn)定性，如維生素C、維生素E和硫代硫酸鈉等。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第11頁①預(yù)防活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶而造成生物活性物質(zhì)損傷；②降低細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差、預(yù)防細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)水結(jié)晶，以保持細(xì)胞活力；③保護(hù)或提供細(xì)胞復(fù)蘇所需營養(yǎng)物質(zhì)，有利于生活力復(fù)蘇和快速修復(fù)本身。

凍干保護(hù)劑作用機(jī)制滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第12頁

二、影響保護(hù)劑效能原因

1、保護(hù)劑種類:依據(jù)微生物種類或者用途來添加不一樣種類保護(hù)劑。２、保護(hù)劑濃度：嚴(yán)格按照配方執(zhí)行。３、保護(hù)劑配制方法：糖類不能用121℃高壓滅菌處理。４、保護(hù)劑酸堿度（PH值）：主要對M影響。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第13頁三、常見凍干保護(hù)劑（穩(wěn)定劑）

明確不一樣種類微生物需要添加不一樣保護(hù)劑（一）細(xì)菌保護(hù)劑①需氧或兼氧厭氧菌：５％蔗糖脫脂乳或５％蔗糖、

1.5％明膠；②厭氧性細(xì)菌：含1.5％谷氨酸鈉１％乳糖或10％脫脂乳或7.5％葡糖血清。

注：脫脂乳：20％脫脂奶粉溶于水配制而成。（二）病毒保護(hù)劑①5%蔗糖脫脂乳；②馬立克814活細(xì)胞疫苗:保留液氮.穩(wěn)定劑為10%二甲基亞砜和50%犢牛血清199液。

注意:微生物保護(hù)劑緩沖液組成百分比，不一樣廠家有不一樣配方。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第14頁1．5%蔗糖（乳糖）脫脂乳保護(hù)劑蔗糖（或乳糖）5g，加脫脂乳至100ml，充分溶解后，110~116℃高壓滅菌30~40min。

2．明膠蔗糖保護(hù)劑明膠

2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲

1%~2%（g/m1）。先將12%~18%明膠液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加熱溶解，116℃高壓滅菌30~40min；

3．SPGA保護(hù)劑

獸醫(yī)生物制品常見保護(hù)劑蔗糖

76.62g、磷酸二氫鉀0.52g、磷酸氫二鉀1.64g、谷氨酸鈉0.83g、牛血清白蛋白10g、加去離子水至1000ml，混合溶解，過濾除菌。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第15頁第三節(jié)免疫佐劑一、佐劑概念與作用機(jī)理1.佐劑（新概念）：凡是能夠增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答物質(zhì)稱為佐劑。

佐劑（舊概念）：當(dāng)一個物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對該抗原特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮其輔佐作用物質(zhì).

以前作為佐劑使用時沒有免疫原性，但現(xiàn)在有所改變，如IL-2是佐劑和IL-8一類細(xì)胞因子佐劑卻不一樣,含有免疫調(diào)整和免疫增強(qiáng)作用,單獨(dú)使用時卻含有免疫原性。注意:佐劑和免疫增強(qiáng)劑關(guān)系?

有時佐劑也是免疫增強(qiáng)劑.滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第16頁作用特點(diǎn)：①顯著增強(qiáng)抗原性微弱物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。②用最少抗原和最少接種次數(shù)，產(chǎn)生足夠免疫應(yīng)答。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第17頁免疫佐劑作用機(jī)理

①改變正常免疫機(jī)能，吸引大量巨噬細(xì)胞以吞噬抗原；②改變抗原構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解，并加強(qiáng)其免疫原性；③延長抗原在組織內(nèi)貯存時間，使抗原遲緩降解和緩釋，并發(fā)揮免疫系統(tǒng)細(xì)胞間協(xié)同作用（巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞，

T細(xì)胞與B細(xì)胞）。

作用方式滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第18頁①抗原遞呈（antigenpresentation）②抗原尋（antigentargeting）③免疫調(diào)整（immunemodulation）

作用機(jī)理滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第19頁①抗原遞呈：指抗原分子遞呈給T細(xì)胞方法。佐劑與疫苗聯(lián)合使用，有利于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第20頁②抗原尋（antigentargeting）指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞效率。包含吸引巨噬細(xì)胞抵達(dá)組織部位、活化吞噬細(xì)胞、促進(jìn)抗原與細(xì)胞受體結(jié)合等有主要作用。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第21頁③免疫調(diào)整（immunemodulation）

是指任何能夠修飾免疫效應(yīng)細(xì)胞反抗原或表位進(jìn)行加工機(jī)制。經(jīng)過這種機(jī)制，能夠改變特異性免疫應(yīng)答本質(zhì)或強(qiáng)度。T細(xì)胞有Th1和Th2兩個亞類。同一抗原和不一樣佐劑一起使用能夠引發(fā)不一樣免疫反應(yīng)。所以，經(jīng)過篩選特定佐劑，能夠到達(dá)誘導(dǎo)正確免疫應(yīng)答目標(biāo)。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第22頁1.按佐劑物理性質(zhì)顆粒型佐劑非顆粒型佐劑2.按佐劑生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法）微生物及其組分非微生物物質(zhì)3.按佐劑在體內(nèi)存留時間貯存型佐劑（depottypeadjuvant）非貯存型（non-depottypeadjuvant）佐劑分類滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第23頁（一）顆粒性佐劑1．鹽類佐劑氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。2．油水乳劑佐劑弗氏完全佐劑（Freund’scompleteadjuvant,FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）和礦物油白油佐劑。3．免疫刺激復(fù)合物佐劑（ISCOM）4．蜂膠佐劑（propolis）5．脂質(zhì)體佐劑（liposomes）。6．其它：MF59佐劑、微囊化佐劑（micro-encapsulation)、硬脂酰酪氨酸佐劑和γ－菊粉等。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第24頁（二）非顆粒性佐劑1．肽類佐劑（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽、脂肽和免疫調(diào)整多肽。2．表面活性分子類佐劑：海藻糖合成衍生物（TDM）3．核酸及其衍生物類佐劑：合成核苷酸聚合體、CpG4．含硫復(fù)合物類佐劑：左旋咪唑5．碳水化合物高分子類佐劑：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6．細(xì)胞因子類佐劑（cytokine）：IL-2、IL-4和γ-IFN等。7．脂質(zhì)分子類佐劑：脂多糖、VitA和VitE等脂溶性維生素8．其它：霍亂毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破傷風(fēng)類毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；維生素B12等。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第25頁合成方法:（1）用鋁粉加燒堿合成法

2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O

A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明礬加碳酸鈉合成法

2KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2↑

（3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成

A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl

氫氧化鋁膠(鋁膠）滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第26頁

用鋁粉加燒堿合成法：

2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O

A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O用銅紗篩濾過，用布袋脫水過夜，收存于容器內(nèi)，可約得600kg鋁膠。取氫氧化鋁干粉50～55kg，加入6萬毫升沸水中，攪拌均勻;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，經(jīng)30～60min后，加溫水，邊加邊攪拌約至總量為35萬毫升；用前加水稀釋至100萬毫升，溫度約為80℃，盛裝在一個缸內(nèi)另一缸盛80kg燒堿，加水至100萬毫升，加溫至75℃兩液等量逐步流入另一耐酸搪瓷缸內(nèi)，蒸汽吹沸熟化10min，調(diào)整pH6.9土0.1，繼續(xù)熟化3min，穩(wěn)定pH6.9土0.1靜置沉淀，棄上清后加入約5倍量軟化水，攪拌洗滌、棄上清，如此3～5次，檢驗至硫酸鹽合格為止。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第27頁①氫氧化鋁吸附力較強(qiáng)，所以要用軟化水或去離子水洗滌。②氫氧化鋁膠為兩性化合物，過酸或過堿都會失去膠態(tài)。故要掌握好化合時pH值。③貯存鋁膠應(yīng)放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，嚴(yán)密封蓋，貯放期不超出3個月。④鋁膠室溫保留，以免破壞膠態(tài)。

注意事項滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第28頁是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定百分比混合形成佐劑。該類佐劑主要在抗原尋過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)提供載體，增加單核細(xì)胞形成和積聚。油乳劑疫苗免疫效力高低，直接與乳化作用好壞和乳劑成份質(zhì)量等相關(guān)。一個好乳劑疫苗應(yīng)是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色。“乳劑”是將一個溶液或干粉分散成細(xì)小微粒，混懸于另一不相溶液體中所成分散體系。被分散物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相液體稱連續(xù)相（外相），兩相間界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。

油乳佐劑滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第29頁乳化劑天然乳化劑：阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳人工合成乳化劑離子型陰離子類乳化劑：十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁陽離子類乳化劑：氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基非離子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂、

司本-80、吐溫-80滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第30頁白油佐劑我國外常見白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-47號或10號白油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):

無色無味

50℃運(yùn)動粘度7m2／s左右紫外吸收A250-350＜0.1％，紫外消光系數(shù)＜12×108；單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無多環(huán)芳烴；小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，觀察60d，表現(xiàn)正常。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第31頁乳劑配方與乳化方法（1）劑在水中法：將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型。該法通常見勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到很好乳劑。（2）劑在油中法：將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制成乳劑，普通均勻顆粒直徑在0.5μm左右，比較穩(wěn)定。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第32頁免疫試驗動物用佐劑配制:

(1)弗氏佐劑：礦物油75%~85％，乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過濾而成為FIA；如向其中加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為FCA。使用時，將含抗原水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻乳劑。(2)白油佐劑：9份油和1份司本-80混合后加2％吐溫-80和1％~2%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好油佐劑與抗原水相1：1混合，強(qiáng)力振搖，可配制成性狀良好乳劑疫苗。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第33頁大量生產(chǎn)乳劑疫苗:

油相:94％白油、6％司本-80、1%~2％硬脂酸鋁，滅菌即可；水相：抗原液加2％~4%吐溫-80

乳化：將油相與水相按3：1~2：1百分比配制，先緩速混合，再經(jīng)過膠體磨充分乳化，可取得穩(wěn)定油包水乳劑苗?；蛘邔⒄吵鞼/O乳劑疫苗，再加2％吐溫-80生理鹽水，經(jīng)過攪拌或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第34頁油乳劑檢驗（1）粘度測定：流出法、Saybolt粘度計法。吸管內(nèi)口直徑為1.2mm，室溫下吸滿lml乳劑，垂直放出0.4ml所需時間作為粘度單位。以2-6S為合格，不得多于10-15S。（2）乳劑穩(wěn)定性測定：①加速老化法：疫苗于37℃貯存10-30d不破乳。②離心加速分層法：3000rpm離心15min不分層，相當(dāng)于保留1年以上不破乳。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第35頁蜂膠佐劑（Propolis）

是一個優(yōu)良天然藥品供免疫佐劑用蜂膠外觀應(yīng)具備其固有特征含有廣泛生物活性和藥理作用（抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎）含有免疫增強(qiáng)作用：能保持抗原特征，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，提升機(jī)體特異性和非特異性免疫力。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第36頁（1）蜂膠處理：蜂膠（4℃以下貯存）粉碎過篩按1：4（W/V）加95％乙醇室溫浸泡24～48h冷卻過濾或離心取上清透明栗色純凈蜂膠浸液4℃以下保留備用除去干渣計算出浸液中含蜂膠量。（2）蜂膠佐劑疫苗制備：滅活菌液或病毒液，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，成為乳濁狀，即可。

蜂膠佐劑疫苗制備方法：滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第37頁細(xì)胞因子類免疫佐劑

（cytokine）

細(xì)胞因子概念

是機(jī)體各種細(xì)胞在其生命周期中所釋放含有不一樣生物學(xué)效應(yīng)物質(zhì)，是免疫細(xì)胞間相互作用調(diào)整信號。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，組成一個巨大細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokinenetwork）系統(tǒng)，各種細(xì)胞借助自己所釋放細(xì)胞因子完成各自功效，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第38頁細(xì)胞因子類免疫佐劑

（cytokine）細(xì)胞因子分類（依據(jù)生物活性）1.經(jīng)典細(xì)胞因子：淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF）干擾素（INF）2.對體液免疫和細(xì)胞免疫含有調(diào)整作用因子：白細(xì)胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第39頁滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第40頁滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第41頁1．多效性：①免疫調(diào)整作用多樣性②作用方式非特異性：不表現(xiàn)抗原特異性2．靶細(xì)胞多樣性：組成機(jī)體細(xì)胞—細(xì)胞調(diào)整網(wǎng)絡(luò)3．多源性：4．高效性：有免疫激素（immunehormone）之稱5．快速反應(yīng)性：即對激發(fā)原因快速反應(yīng)細(xì)胞因子作用特點(diǎn)滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第42頁

多樣性Pleiotropism

交叉性Redundancy

協(xié)同性Synergy

反抗性Antagonism滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第43頁1．作為免疫佐劑，提升疫苗免疫效果2．作為免疫治療劑，預(yù)防和治療一些病原感染3．經(jīng)過基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗

IL-2-AIV-HA重組痘病毒細(xì)胞因子應(yīng)用滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第44頁幾個主要細(xì)胞因子

白細(xì)胞介素-2（IL-2）白細(xì)胞介素-4（IL-4）白細(xì)胞介素-12（IL-12）

γ-干擾素（IFN-γ）滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第45頁

刺激物為抗原或促有絲分裂原（ConA）；

T細(xì)胞分泌；無抗原特異性糖蛋白，含133aa，分子量15-35kDa；70℃30min及pH值2-9范圍內(nèi)穩(wěn)定IL-2滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第46頁刺激物：抗原或絲裂原；由Th細(xì)胞產(chǎn)生分子量15～20kDa，有2～3個糖基化部位，140個氨基酸一個強(qiáng)有力佐劑候選因子IL-4滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第47頁

是當(dāng)前發(fā)覺唯一主要由B細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF）。

糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個亞單位組成，兩個亞單位完全由不一樣基因所編碼，只有結(jié)合為一個完整分子時才能發(fā)揮生物學(xué)活性。

IL-12活性高于IL-2和IFN，在極低濃度時就有顯著活性，對滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原含有有效佐劑活性。

IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，可望用于主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答疫苗佐劑。

IL-12滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第48頁

由致敏T細(xì)胞在活或滅活病毒等干擾素誘生劑和一些細(xì)胞因子作用下所產(chǎn)生；糖蛋白，分子量20～25kDa，由144個氨基酸組成。有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)整和免疫佐劑等免疫生物學(xué)活性。當(dāng)前IFN-γ與抗原雜合融合分子研究是個熱點(diǎn)，期待其成為一個有效佐劑。IFN-γ滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第49頁當(dāng)前，我國已開發(fā)研制成功豬白細(xì)胞干擾素（swineinterferon）。該制品系用雞新城疫病毒誘導(dǎo)健康豬白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第50頁CpGDNA，CpGOND

CpGDNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序脫氧核糖核酸DNA。

CpG基序（

motif）：指以非甲基化CpG為基元組成回文序列，其堿基排列大多為5′--PurPur-CG-PyrPyr--3′，含有較強(qiáng)免疫活性，稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatoryDNAsequences）。

CpGOND：含有非甲基化CpG基序寡聚脫氧核苷酸。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第51頁細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞分化CpGDNA免疫刺激效應(yīng)（作用機(jī)制）溫度\能量酸化內(nèi)體小泡DNA-PKTLR-9胞質(zhì)內(nèi)受體蛋白有絲分裂原蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等信號通路滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第52頁

引發(fā)B細(xì)胞分化，分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子和表示MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B細(xì)胞凋亡。直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，分泌IL-12、INF-r等Thl樣為主細(xì)胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2表示。在IL-12協(xié)同下激活NK細(xì)胞，殺傷活性增強(qiáng)，并分泌IFN-r，IFN-r反過來深入促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞激活。協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，在Thl細(xì)胞因子作用下，顯著增強(qiáng)取得性細(xì)胞免疫----優(yōu)良T細(xì)胞免疫佐劑。1．

CpGDNA對各種免疫細(xì)胞有激活作用

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第53頁含有GACGTT-基序CpGOND——小鼠淋巴細(xì)胞含有AGCGTG基序CpGOND——小鼠NK細(xì)胞含有GTCGTT基序CpGOND——人淋巴細(xì)胞含有ATCGAT基序CpGOND——雞外周血單核細(xì)胞含有GTCGTT基序CpGOND—牛B細(xì)胞增殖和分泌IL-6—PBMC分泌IL-6、IL-l2和IFN-r；含有ATCGAT基序CpGOND——豬

(Kamstrup，)2．CpGOND免疫刺激作用含有物種和細(xì)胞特異性滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第54頁CpGODN體內(nèi)效應(yīng)與應(yīng)用1．對天然免疫系統(tǒng)刺激活性

（1）抗感染：單核李斯特桿菌、利什曼原蟲、

瘧原蟲、單純皰疹病毒

（2）抗腫瘤活性：黑色素瘤

2.對特異性免疫反應(yīng)調(diào)整作用—疫苗佐劑（1）CpGODN對蛋白質(zhì)抗原作用能夠增強(qiáng)許多抗原誘導(dǎo)Thl型反應(yīng)—HbsAg、牛皰疹病毒I型糖蛋白

D、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、瘧疾多肽、麻疹病毒、放線桿菌胸膜肺炎、流感病毒疫苗、貓皰疹病毒、貓細(xì)小病毒和貓白血病病毒（2）CpGONG對DNA疫苗作用3．過敏性疾病治療滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第55頁

霍亂毒素（CT）大腸桿菌不耐熱毒素（LT）破傷風(fēng)類毒素（TT）基因工程減毒素

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第56頁（一）霍亂毒素（CT）良好粘膜免疫佐劑由A和B兩個區(qū)組成蛋白

B區(qū)含有主要免疫學(xué)作用，內(nèi)含5種獨(dú)立非共價連接B亞單位（CTB），無毒性，可與細(xì)胞結(jié)合。

A區(qū)是CT生物學(xué)活性個別，含有酶活性。仙臺病毒—CT；CTB—流感病毒HA；鏈球菌表面蛋白—CTB；

CT毒素A和B兩個亞單位表示質(zhì)粒DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)和應(yīng)用，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（如IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（如IL-4），含有很強(qiáng)佐劑作用。

滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第57頁（二）大腸桿菌不耐熱毒素（LT）大腸桿菌LT毒素有A和B兩個亞單位，有一定抗原性

A亞單位基因工程點(diǎn)突變體LT(R192G)——無毒性作用，但仍保留了其佐劑效應(yīng)

——可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建A和B兩個亞單位表示質(zhì)粒DNA聯(lián)合應(yīng)用，也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（IL-4）。而且，LT毒素表示質(zhì)粒作為佐劑，可幫助DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，有望成為一個新型免疫增強(qiáng)劑。滅活劑保護(hù)劑和免疫佐劑第58頁免疫刺激復(fù)合物（immunostimulatingcomplex，

ISCOM）

ISCOM由抗原物質(zhì)與由皂樹皮提取一個糖苷QuilA和膽固醇按1:1:1混合后自發(fā)形成一個含有較高免疫活性脂質(zhì)小泡。

ISCOM直徑40nm，每個ISCOM約含10～12分子蛋白質(zhì)。

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