微生物資源分子鑒定技術的研究進展

一、前言微生物無處不在，與人類的生存、生產和生活息息相關。微生物用途廣泛，可用于生產如奶酪、酒、酸奶、面包、饅頭等食品，也可用于凈化水源、吸附重金屬等領域，人體內的腸道微生物可助力食物的降解和吸收。微生物的存在鏈接了自然秩序和人類生活的方方面面，微生物與人類健康密切相關，多數微生物是無害的，能與寄主和平共存。微生物中對人、動物、植物產生危害或致病的一類微生物，統(tǒng)稱為病原微生物。病原微生物會引發(fā)寄主感染、過敏、腫瘤、癡呆甚至死亡，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現的嚴重急性呼吸綜合征（SARS）、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染、新型冠狀病毒肺炎等疾病傳染性強、對人體危害極大，為保障人類身體健康、食品安全和糧食安全，需要對醫(yī)學、環(huán)境、農業(yè)、食品等領域中的微生物進行快速、精準、靈敏的檢測以及準確的分型。傳統(tǒng)的微生物檢驗包括菌落形態(tài)、生理生化指標、血清型檢測等常見致病菌檢驗流程，具有技術成熟、設備簡單等優(yōu)點，是目前食品衛(wèi)生監(jiān)管機構采用的主流檢測方法；然而實驗操作時存在步驟繁瑣、耗時、靈敏度低等問題，致使得出的檢測結果缺乏充分的說服力。隨著醫(yī)學微生物學研究技術和交叉學科的發(fā)展，新的微生物檢測技術不斷出現，克服了傳統(tǒng)方法在檢測和鑒定微生物方面的一個或多個局限性。目前，新的微生物檢測技術已深入到分子水平、基因水平的檢測，包括核酸雜交技術、核酸擴增技術、脫氧核糖核酸（DNA）指紋圖譜技術、基因芯片技術和高通量測序技術等。隨著技術及自動化設備的發(fā)展，顯著提升了微生物檢測的快速性、敏感性、特異性和適用性。同時，也應看到，每種微生物檢測方法都有其自身的優(yōu)點以及在耗時、靈敏度、穩(wěn)定性、實驗環(huán)境等方面存在一個方面或多個方面的局限性。針對于此，本文著重梳理微生物資源分子鑒定方法的發(fā)展進展和應用態(tài)勢，分析存在的問題，提出我國微生物資源分子鑒定方法的發(fā)展建議，以期為相關研發(fā)布局和管理政策研究提供基礎性參考。二、微生物資源分子鑒定方法概述微生物的群體特性對微生物檢測技術提出了挑戰(zhàn)，不僅要能檢測出微生物，還要檢測出微生物的變異情況，及時對微生物進行分型。微生物資源的分子鑒定是指利用微生物在長期進化過程中保留下來的保守基因組序列及其細微變化與規(guī)律，進而對自然界中微生物資源的生物學進化多樣性進行分類和定位。分子鑒定已成為微生物資源鑒定中必備的分類信息，同時也是進行微生物資源快捷鑒定的重要方法。常見的分子鑒定技術包括以下幾種技術。（一）DNA含量測定遺傳物質DNA的特異性是由常見的4種堿基腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）的排列和含量所決定的。不同生物的DNA含量測定通常用DNA中（G+C）的含量摩爾分數值表示，因其具有種特異性且不受菌齡及外界因素影響，成為細菌分類和菌種鑒定的重要指標。不同微生物DNA的（G+C）含量變化范圍比較廣，但同種微生物的（G+C）含量僅在3%~5%區(qū)間波動。因此，DNA含量測定法通常用于快速確定微生物所屬種群。親緣關系密切或表型高度相似的微生物僅會具有相似的（G+C）含量，但不會完全相同；并且同一屬細菌之間的（G+C）含量差異不會超過12mol%，種與種之間的差異小于5mol%，為此可以通過數據差異判斷細菌之間親緣關系的遠近。需要說明的是，這種鑒定方法主要用于排除不確定的分類單元，而不是去建立一個新的分類單元，即親緣關系近的種，（G+C）的含量一定相近；但（G+C）含量相近的種，親緣關系卻不一定相近。（二）核酸雜交技術核酸雜交技術是用于微生物檢測的最早的分子生物學技術，指利用帶有標記物的已知序列的核酸探針與靶序列雜交，再用特定的方法檢測特異結合的探針。每種微生物都有其特殊的核酸片段，經分離標記后，制備出探針，通過檢測探針，對DNA序列片段進行定性和定量分析，最終開展微生物鑒定。該技術具有操作較為簡單、特異性較好、敏感度高、速度快等優(yōu)點，主要有印記雜交、斑點雜交、原位雜交等方法。其中，在原位雜交方法基礎上發(fā)展起來的熒光原位雜交技術（FISH），在對有熒光標記的探針進行雜交后，使用熒光顯微鏡進行檢測，已獲得廣泛應用；該方法易受雜交溫度、反應條件、熒光染料、探針選擇等影響。需要指出的是，核酸雜交技術需要運用放射性同位素，成本較高且會對人體產生一定傷害，在一定程度上限制了技術的應用與發(fā)展，但生物傳感器技術與之結合后，顯著提升了其效益。

（三）核酸擴增技術

1.聚合酶鏈式反應（PCR）技術PCR技術是微生物檢測最常用的分子方法之一，也是現行微生物檢測國家和行業(yè)標準中常用的檢測技術之一。PCR技術通過包括模板變性、引物退火和產物延伸的兩步或三步的溫度循環(huán)來擴增一個特定的目標DNA序列。根據一次檢測目標的數量多少，可以將基于PCR的微生物檢測技術分為單重PCR技術和多重PCR技術。①單重PCR技術是指一次PCR反應只擴增一對引物的檢測方法，適用于高保守性的微生物種或屬的檢測。通過檢測目標微生物種特異及種內保守的DNA序列，將一對引物的檢測結果與目標微生物進行判定，如對洋蔥泛菌屬、茄子致病菌的檢測。單重PCR技術一次只能檢測一個目標，存在檢測效率低、單對引物擴增失敗導致產生高假陰性和低靈敏度等問題。②多重PCR技術是指一次PCR反應擴增多對引物，可以進行多個靶標檢測的方法。多重PCR技術可以一次檢測多個目標微生物，或者一次檢測一個目標微生物的多個目標序列，顯著提高了檢測效率和檢測的準確性。多重PCR技術已用于沙門氏菌的多個血清型，真菌類微生物，眼部細菌性致病菌，病毒性腦膜炎兒童患者腦脊液中的18種致病菌，糞便樣本中的15種腸道致病菌以及11種食源性致病菌的檢測。根據PCR體系發(fā)生的場所，基于PCR的檢測技術還包括將PCR體系整合在液滴中的液滴PCR、將PCR引物固體在固定支持物上進行的固相PCR等，但由于操作較為復雜、成本比較高，尚未廣泛應用。在實際應用中，熒光PCR技術是比較常用的，是我國現行病原微生物檢測國家標準及行業(yè)標準中常采用的技術。熒光物質的發(fā)現簡化了PCR產物的檢測步驟，在單重或多重PCR反應體系中加入熒光物質，通過熒光信號的積累，實時監(jiān)測PCR產物的形成，因此，熒光物質的加入實現了PCR技術對目標微生物的實時定量檢測。熒光PCR技術通常與多重PCR聯合，進行多靶標的實時定量檢測。常用的熒光物質有熒光染料（如SYBRGreen核酸染料）和熒光探針（如TaqMan探針）。例如，基于SYBRGreen方法，對眼部的多種細菌性致病菌和糞便樣本中的15種腸道致病菌進行了檢測；基于TapMan探針法，對洋蔥泛菌屬和多抗藥的假絲酵母進行了檢測，對新型冠狀病毒進行了檢測。目前，依賴于熒光PCR儀的多重PCR一次性檢測的引物數量偏少，在多微生物同時檢測時，一種微生物通常只能檢測一個目標序列，因此存在因為一個序列檢測失敗而認為該微生物不存在的的假陰性問題。2.等溫擴增技術等溫擴增技術是在等溫條件下擴增核酸進行檢測的技術，該技術簡化了核酸擴增的裝置，在基層、即時微生物的分子診斷等方面被廣泛應用。根據所添加的活性酶的不同，常見的等溫擴增技術有環(huán)介導核酸等溫擴增技術（LAMP）、滾環(huán)擴增技術、單引物等溫擴增技術、依賴解旋酶的等溫擴增技術等。等溫擴增技術具有以下特點：①操作簡單，與常規(guī)PCR技術相比，不需要模板的熱變性、電泳及紫外觀察等過程，只需要水浴鍋即可，產物檢測結果用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度即可判斷；②無需溫度循環(huán)，速度快；③特異性極高，

6個靶區(qū)域的任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增；④靈敏度高，對于病毒模板的檢測可低至幾個拷貝，比PCR技術高出數量級的差異。等溫擴增技術已被廣泛用于病原菌檢測，如蘋果腐爛病菌、馬鈴薯環(huán)腐病、甘蔗宿根矮化病菌等植物類病原菌，魚鏈球菌、魚乳球菌等動物致病菌和人類呼吸道病原菌。（四）DNA指紋圖譜技術DNA指紋圖譜技術是用DNA指紋圖譜對DNA序列進行分型、對微生物在種水平上進行鑒定的一種技術?；贒NA的分型方法簡單易操作、重復率和分辨率都很高。DNA指紋圖譜技術的特點有：①多位點性，可以更加全面反映基因組的特征；②高變異性，即不同的物種之間具有不同的DNA圖譜；③簡單且穩(wěn)定的遺傳性，即DNA圖譜能準確地從上一代傳到下一代。目前，該技術已成為分類鑒定及分類研究的常規(guī)方法，不僅用于在不同水平上的微生物的多樣性、分類、系統(tǒng)學研究，還用于微生物的進化關系及生態(tài)研究。DNA指紋圖譜技術的基本方法是先對提取的基因組DNA進行酶切，再用瓊脂糖凝膠電泳將其分離，用探針標記后進行Southern印跡雜交顯色，最終獲得DNA指紋圖譜，對圖譜進行一系列分析后可得到相應的信息，最后確定菌株的親緣關系。DNA指紋圖譜技術常用的方法有變性梯度凝膠電泳（DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）、重復序列PCR（Rep-PCR）、多位點可變數目串聯重復序列分析（MLVA）、多位點序列分析技術（MLST）等?；赑CR技術的DNA指紋圖譜技術，由于聯合使用兩種技術，可不用建立基因文庫，是目前普遍使用的方法。每種方法的應用特點不同，可根據情況應用于不同的微生物鑒定中；由于鑒定方法不可避免存在一些不足，為此在具體實驗中通常選擇一起使用兩種方法。

（五）基因芯片技術基因芯片技術是生物芯片技術的一種，利用雜交技術實現基因檢測，使用效果佳。該技術是一種高科技技術，利用微加工技術，將數以萬計特定序列的DNA片段規(guī)則排列并固定于支持物上，構成一個二維DNA探針陣列，因其類似于計算機的電子芯片，故被稱為基因芯片技術?；蛐酒夹g特異性強且高通量，可一次性檢測樣品中的多種微生物，在檢測結果出來后，能夠全自動分析檢測結果，并用生物學知識分析信息結果。基因芯片技術在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測、基因組監(jiān)測等研究領域中的作用顯著?；蛐酒夹g實現了高通量的檢測，檢測效率顯著提高。該技術是基于顯色或是熒光信號進行的，存在背景噪音大、靈敏度偏低等問題，雖然可以檢測目標微生物的有無，但無法檢測序列變異的情況，無法對微生物進行分型。另外，現有的芯片多是點陣列型的雜交芯片，盡管已有一些商業(yè)化的芯片，但仍不能滿足實際應用的需求；芯片功能有限，需要根據需求進行定制，成本較高，靈活性差。（六）高通量測序技術基于雙脫氧鏈中止（Sanger）法產生了第一代測序技術，在此基礎上發(fā)展了下一代測序（NGS）技術，NGS方法已能快速、高效地進行全基因組測序。2011年發(fā)展的第三代測序技術序列讀長已高達3000bp，與前兩代測序技術相比，其最大的優(yōu)點是不需要進行PCR擴增，避免了因PCR帶來的錯誤。得益于測序技術的不斷發(fā)展，數百萬個PCR擴增子測序能夠同時進行，檢測效率顯著提高。1.全基因組測序（WGS）、宏基因組測序（mNGS）和靶向測序技術WGS技術能夠準確區(qū)分菌株間的基因組差異，且具有高度的重現性，不僅可以用于預期的單核細胞生長監(jiān)測，還可以用于其他與公共衛(wèi)生相關的病原體報告，是細菌分離物暴發(fā)監(jiān)測和調查的有力工具。WGS測的是微生物的整個基因組序列，獲得的信息很全面，但也因此依賴于對微生物的分離培養(yǎng)，耗時費力。微生物的群體特性需要深度測序才能準確的檢測，這對于全基因組測序來說成本會很高。宏基因組指的是環(huán)境中所有微生物基因組的總和。mNGS技術不對微生物特定種群進行單一性測序（如真菌、細菌或者病毒），而是考慮所有微生物基因組的總和。正因為此，測序產生的數據中會存在大量背景數據，對這些數據的質量控制和科學分析成為有效利用mNGS數據的重點和難點。此外，mNGS技術的另一個局限是目標微生物淹沒在大量背景數據中，尤其是目標微生物含量很低時，需要通過加強測序深度才能檢測到該微生物，導致成本提高。靶向測序技術針對特定的微生物種群，可以低成本地實現超深度測序。在準確性和靈敏性方面，該技術較mNGS技術明顯改進，可以與mNGS技術實現優(yōu)勢互補，全面準確地檢測微生物。常見的靶向測序技術有16S擴增子測序（16SrRNA）、18S擴增子測序（18SrRNA）、核糖體間隔基因分析（RISA）。16SrRNA是細菌、古生菌屬種鑒定與分類學研究中應用最廣泛的標記基因；18SrRNA是真菌中常用的系統(tǒng)發(fā)育基因，它比16SrRNA具有更多的高變結構域；基因間的間隔區(qū)（ITS）因具有良好的可變區(qū)和保守區(qū)受到人們的廣泛關注，在種及亞種的鑒定上優(yōu)越性突出，是一種廣泛應用的通用真菌條形碼標記，可用于真菌的成功鑒定。16SrRNA、18SrRNA、ITS靶向測序技術不僅可以低成本的檢測出微生物，還可以在屬或種的分類水平上進行分型。

2.多核苷酸多態(tài)性（MNP）標記MNP標記是一種新型微生物鑒定方法，是一種包含多個分散核苷酸多態(tài)性標記的新型DNA標記方法。目前，MNP標記已被采用作為我國國家植物身份鑒定基因分型的技術標準。該方法開發(fā)了微生物遺傳變異測序技術（MGV-Seq）及其配套的生物信息學分析工具，更重要的是設計了一種基于MGV-Seq的微生物鑒定程序，為MNP基因分型開發(fā)了一種定制的計算和統(tǒng)計算法。MGV-Seq方法具有高重現性、高準確性、高敏感性和高特異性等特點。對白葉枯病毒（Xoo）菌株的檢測證明了MGV-Seq方法對微生物鑒定的適用性、可行性和重現性。Xoo菌株自1972年被分離出來后，被世界各地的實驗室使用并進行了多年的培養(yǎng)，在運用MGV-Seq檢測時，意外發(fā)現了一些被標記為Xoo的菌株并不屬于Xoo家族，而是屬于黃單胞菌（Xcc）物種的情況；另外還發(fā)現，即使是已申報的Xoo菌株，也可能是一種不同的菌株。三、微生物資源分子鑒定技術存在的問題對微生物尤其是病原微生物進行快速準確的檢測、鑒定是食品檢疫、臨床檢測和傳染病防治工作的首要問題。分子生物學技術的進步為微生物檢測方法的發(fā)展提供了契機，檢測水平從組織形態(tài)學水平深入到分子水平、基因水平，檢測模式也從對可能的病原體單一靶向檢測模式發(fā)展到涵蓋常見病原體組合的檢測模式，實現了對一份樣品進行一次檢測就可以診斷或排除多種病原體。不同的微生物資源分子鑒定技術適用性不同，各有優(yōu)劣勢，如表1所示。目前，尚未有針對微生物資源鑒定選擇的研究，但無論使用哪種方法，都需要考慮鑒定成本、重現性、可靠性以及對菌株的鑒別能力等。當前，微生物資源鑒定技術存在以下幾大問題。表1?不同微生物資源分子鑒定技術的優(yōu)缺點

（一）依賴于實驗室環(huán)境目前，用于微生物資源分子鑒定的實驗方法多處于實驗室階段，僅作為標準檢測方法的對照參考，尚未廣泛應用，亟需發(fā)展不依賴于實驗室環(huán)境的鑒定方法，如用于快速鑒定的試劑盒。同時，大部分微生物鑒定技術都需要進行增菌培養(yǎng)以提高檢出率，導致檢測時間延長，無法及時獲得檢測結。未來應開發(fā)不需要增菌培養(yǎng)或者縮減增菌時間的鑒定方法以提高檢測效率。此外，例如高通量測序技術中的方法雖適用于實驗室研究，可以得到準確的檢測結果，但存在數據處理復雜、無法在實際應用中迅速獲得檢測結果的問題。過分依賴于實驗室環(huán)境，在不同實驗室、由不同實驗人員操作時，對獲得的檢測結果可能存在無法進行處理分析的情況，因此檢測結果的統(tǒng)一化和標準化勢在必行，有利于對實驗結果進行交流。（二）實驗結果的重現性、準確性不夠微生物能夠迅速繁殖并存活，使遺傳變異在微生物中普遍存在，為此，微生物已被廣泛用于生物學和臨床研究中。致病微生物的基因變異可以改變病毒毒力，具有耐藥性，降低疫苗療效，明顯影響其與宿主的相互作用；同源菌株的遺傳變異使實驗結果的重現性面臨風險。為了實現實驗結果的再現性，需要確保同一微生物在多個實驗中用于相同的實驗目的。微生物鑒定需要檢測菌株內（MGVI）和菌株之間（MGVB）的遺傳變異，現有的微生物變異檢測方法，如脈沖場凝膠電泳技術（PFGE）、多位點的可變數目串聯重復分析（LIVA）和多位點序列分型（MLST），尚不能明確區(qū)分密切相關的菌株，為此，通常采用增加測序深度、改進測序庫準備方法和優(yōu)化生物信息學分析方法，如采用超深的WGS以檢測出罕見的變體，但會導致鑒定成本增加。準確性作為評價微生物鑒定技術的重要指標，在選擇鑒定方法時要著重考量。而已有的微生物資源分子鑒定技術無法獲得精準的結果，如運用DNA含量測定時，僅依靠（G+C）含量無法準確判斷微生物的菌株屬性；PCR技術和基因芯片技術會出現假陰性問題，在實驗過程中，對實驗條件或者操作的要求比較高，若稍有不慎就會影響結果準確性。WGS技術雖然能獲得十分準確的結果，但檢測成本卻偏高。（三）缺乏相應的微生物數據庫和鑒定平臺目前，我國微生物資源基因組信息的數據庫建設仍處于起步階段，相關微生物基因組學、代謝組學、轉錄組學、蛋白質組學等信息依賴于國外數據庫，其中美國國家生物技術信息中心（NCBI）的數據庫占據主導優(yōu)勢。例如，就基因芯片技術而言，在進行鑒定時，需要細菌的特異基因或者核糖體基因信息來進行靶基因的設計，因此完善的基因組學數據庫就顯得尤為重要。目前初步應用的微生物DNA鑒定平臺主要依賴16SrRNA基因、ITS基因和特異基因鑒定技術。16SrRNA和ITS基因鑒定技術僅能分辨到種或者屬的分類水平，不能精細區(qū)分有害和有益微生物小種；特異基因鑒定技術一次僅能鑒定10種以下微生物的種或小種，不能同時檢測食品中的多種微生物。另外，為避免氣溶膠污染，這類鑒定技術對實驗室環(huán)境和人員要求都較高?；?6SrRNA、ITS等技術對微生物資源進行鑒定時，對國外設備的依賴性強，如來自伊勒米納公司（Illumina）和賽默飛世爾科技公司（ThermoFisherScientific）等公司設備，存在價格高、耗材貴、鑒定技術的知識產權無法保護等劣勢。高端試劑、高端儀器設備等的“卡脖子”現象嚴重，亟待建立具有自主知識產權的微生物DNA鑒定平臺。四、發(fā)展建議微生物分類鑒定已經成為微生物學科研究的重要組成部分，它不僅能闡明微生物資源的生物學地位與本質，還是實現微生物資源利用的重要步驟。目前，由于沒有精準的微生物資源鑒定方法，盜取微生物菌種的現象時有發(fā)生，不僅給生產企業(yè)造成了一定經濟損失，也給花費幾年甚至幾十年的微生物菌種研究者造成了無法彌補的損失，