檸檬酸（citricacid,CA）含量測定試劑盒說明書

第第頁檸檬酸（citricacid,CA）含量測定試劑盒說明書檸檬酸（citricacid,CA）含量測定試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定之前選擇23個預(yù)期差別大的樣本做猜測定。測定意義：CA是生物體內(nèi)常見的有機酸，是緊要的食品風(fēng)味物質(zhì)。另外，CA是三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)的產(chǎn)物。測定原理：酸性條件下，檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+，在545nm處有特征汲取峰；通過測定545nm吸光值的加添，即可計算出樣品中檸檬酸含量。自備儀器和用品：低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配置：試劑一：液體×1瓶，4℃保管。試劑二：液體×1瓶，4℃保管。試劑三：液體×1管，—20℃保管。試劑四：粉劑×1管，室溫保管。臨用前配制，加入2mL試劑一，充分溶解。試劑五：液體×1管，4℃避光保管。標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1管，250μmol/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保管。樣品中檸檬酸提?。?.液體樣品中檸檬酸提取：取0.1mL液體加試劑一0.9mL，充分混勻，11000g，4℃離心10min，取上清液，待測。2.組織中檸檬酸提?。阂勒战M織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。3.線粒體中檸檬酸提取：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，600g/min，4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃離心10min，棄上清（此上清液可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測定）；向沉淀中加試劑二200μl，以及試劑三2μl，充分懸浮溶解，11000g，4℃離心10min，取上清液，待測。4.細(xì)菌、真菌中：依照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。測定操作：1.分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長到545nm，蒸餾水調(diào)零。2.試劑一置于30℃水浴中預(yù)熱30min。3.空白管：取0.5mLEP管，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A空白管。4.標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mLEP管，依次加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。5.測定管：取0.5mLEP管，依次加入20μL上清液，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，充分混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度，記為A測定管。注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。計算公式：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下1.按液體樣品的體積計算檸檬酸含量（nmol/L）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]×樣品稀釋倍數(shù)×V總=2500×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25mmol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1mL樣品+0.9mL試劑一）÷0.1mL樣品=10；V總：1mL。2.按組織質(zhì)量計算檸檬酸含量（nmol/g鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]×V總÷W=250×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）÷WC標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L；V總：上清液總體積，1.0mL=0.001L；W：樣品質(zhì)量，g。3.按蛋白含量計算檸檬酸含量（nmol/mgprot）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]÷Cpr=250×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）÷CprC標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25μmol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。4.按細(xì)胞數(shù)量計算檸檬酸含量（nmol/104cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]×V總÷細(xì)胞數(shù)量=250×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L；V總：上清液總體積，1.0mL=0.001L；b.使用96孔板測定的計算公式如下3.按液體樣品的體積計算檸檬酸含量（nmol/L）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]×樣品稀釋倍數(shù)×V總=2500×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25mmol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1mL樣品+0.9mL試劑一）÷0.1mL樣品=10；V總：1mL。4.按組織質(zhì)量計算檸檬酸含量（nmol/g鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]×V總÷W=250×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）÷WC標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L；V總：上清液總體積，1.0mL=0.001L；W：樣品質(zhì)量，g。5.按蛋白含量計算檸檬酸含量（nmol/mgprot）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]÷Cpr=250×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）÷CprC標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25μmol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。6.按細(xì)胞數(shù)量計算檸檬酸含量（nmol/104cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）]×V總÷細(xì)胞數(shù)量=250×（A測定管—A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管—A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L；V總：上清液總體積，1.0mL=0.001L；