桃樹黃化植原體檢疫鑒定方法

桃樹黃化植原體檢疫鑒定方法(資料性附錄)植原體生物學(xué)特性主要對桃樹葉片以及果實進(jìn)行癥狀觀察。該植原體病害最典型癥狀為葉片黃化，果實較小，植株長勢衰遐、提前落葉。A.2寄主范圍桃樹是主要的寄主，包括碧桃(Prnnuspersica),毛桃(Awygdalvspersica)等。A.3傳播途徑主要由取食植株韌皮部的介體昆蟲傳播，如葉蟬(Fieheriellafluri)、蚜蟲(Aphidae)等；感病桃樹種苗、接穩(wěn)等調(diào)運可以使植原體病原遠(yuǎn)距離傳播。桃植株之間的嫁接可以傳播桃黃化病，另外，嫁接能夠?qū)⒅苍w從桃樹傳到長春花上。A.4地理分布北京、四川等，其他國家無報道。(資料性附錄)電子顯微鏡觀察B.1試劑試材B.1.1鋨酸固定液巴比妥-乙酸緩沖液的1%鋨酸固定液巴比妥鈉(C?HN?O?Na)2,89g乙酸鈉(CH,COONa)1,15g加雙蒸餾水至100mL0.1mol/L.鹽酸(HCl)加雙蒸餾水至25.0mL.?；旌虾笥?,1mol/1.鹽酸調(diào)至pH為7.2,即為1%鋨酸固定液，在冰箱保存?zhèn)溆?。B.1.2戊二醛固定液一般為25%戊二醛水溶液?？膳渲圃诔捅韧滓酝獾娜魏尉彌_液中使用，終濃度為25%。B.1.3環(huán)氧樹脂順丁烯二酸酐(DDSA)鄰苯二甲酸二丁酯(D.B.P)二乙基苯胺(D.M,P-30)將Epon812倒入燒杯中，置80℃溫箱融化備用。按上述比例，飄序加入DDSA,充分?jǐn)嚢?，待熔化呈透明，至室溫，再加入鄰苯二甲酸二丁酯，仔?xì)攪排，然后慢慢逐滴加入二乙基苯胺，邊加邊攪排，至包埋劑呈紅棕色。將聚乙烯醇縮甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱備用。制膜時取一塊干凈玻璃片插入溶液中，取出傾斜待三氯甲烷揮發(fā)，用鑷子沿玻璃邊劃痕，再將玻璃傾斜浸入蒸餾水中，薄膜即從玻璃上脫落下來漂浮于水面，取干凈的銅網(wǎng)擺上，壓緊，在用一塊濾紙覆蓋其上，撈起后置于培養(yǎng)皿干燥備用。B.2實驗步驟選取呈現(xiàn)癥狀的桃樹葉片或者幼敏莖，用刀片切取葉脈、葉柄或者幼嫩枝條，大小為3mm2。取健康桃樹葉片作為陰性對照。采用戊二醛-鋨酸雙固定法。樣品在25%戊二醛進(jìn)行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4)清洗三次。然后用1%俄酸后固定2h,PBS清洗三次。采用乙醇和系列梯度脫水。30%乙醇/15min→50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙酮/15min→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。樣品可在70%乙醇中停留過夜。脫水后的組織塊在丙酮/樹脂(1:1)中滲透3d,再在全樹脂中滲透1d,用環(huán)氧樹脂做包埋劑。將組織塊放在膠囊中央，滴入包埋劑。于37℃下24h,45℃下24h,60℃下24h。在超薄切片機(jī)上將固化的組織塊作切片。選擇好的切片，將切片用二甲苯蒸發(fā)展開，用載有Formvar膜的銅網(wǎng)撈起，置培養(yǎng)皿內(nèi)干燥、保存。B.2.7切片染色采用乙酸雙氧鈾和檸橡酸鉛雙染色。取染色蠟盤數(shù)個，將乙酸雙氧鈾染色滴入蠟盤上。取帶切片的銅網(wǎng)，插人染色滴中，染20min~30min.然后取出銅網(wǎng)，蒸餾水洗去多余染液濾紙吸干。將銅網(wǎng)再放入另一蠟盤，滴入檸檬酸鉛染液，使銅網(wǎng)翻扣在染色液滴上，染20min~30min,再用0.1mol/L氫氧化鈉漂洗干凈，濾紙吸干。B.2.8顯微鏡觀察透射電子顯微鏡觀察植原體形態(tài)，如圖B.1.圖B.1植原體形態(tài)(引自Bertaccini.2007)(資料性附錄)植原體DNA的提取C.1植原體細(xì)胞的富集C.1.1溶液配制植原體細(xì)胞富集緩沖液(100mL):無水K?HPO?1.67g,KH?PO?0.41g,蔗糖10g,牛血清白蛋白0.15g,PVP-102g,維生素C0.53g,用5mol/L的KOH調(diào)節(jié)pH值至7.6。C.1.2植原體細(xì)胞的高集方法稱取新鮮樣品葉中脈1,5g,加人7mL~8ml.新制備的富集緩沖液，50mg的石英砂，于研缽中研磨。冰上放置10min~15min,加入5ml.相同的緩沖液并搖晃均勻；將懸濁液轉(zhuǎn)移至15ml.離心管，5000r/min使用預(yù)冷的離心轉(zhuǎn)頭(BeckmanJA20)4℃離心5min,將上清液移至另一個離心管中，19000r/min離心20min.干燥沉淀并用60℃預(yù)熱的2ml2%CTAB溶液，重懸沉淀；60℃水溶中溫溶，并不定期的據(jù)動。C.2.1溶液配制DNA提取緩沖液：2%CTAB(50℃左右溶解》,1.4mol/LNaCl,20mmol/L.EDTA,100mmol/L.C.2.2DNA提取方法將1ml.富集樣品轉(zhuǎn)移至2mL離心管。加人1mL.DNA提取緩沖液；將離心管置于65℃水溶中溫浴1h~1.5h,每隔20min左右將離心管顛倒混勻；2000g.4℃離心2min;將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，加入三氯甲烷/異戊醇(24/1)1mL,混勻，形成乳濁液；將乳濁液在13000g的條件下，離心5min;將上清液轉(zhuǎn)入新管，加入800μL預(yù)冷的異丙醇，15000g條件下，離心10min:棄上清液，加入500pL的70%乙醇，在15000g的條件下，離心5min:棄掉上清液，干媒沉淀，加入100pL的滅菌蒸餾水溶解。其他的DNA提取方法也可以借鑒，也可以選擇使用商業(yè)DNA提取試劑盒，提取的DNA在一80℃的條件下可以凍存1年。(規(guī)范性附錄)通用引物PCR檢測植原體通用引物：R16F2n:5'-GAAACGACTGCTAR16R215'TGACGGGCGGTGTGTACAAACD.2PCR反應(yīng)體系及參數(shù)D.2.1PCR反應(yīng)體系表D.1PCR反應(yīng)體系補(bǔ)H?O至D.2.2陰性對照、陽性對照和空白對照的設(shè)置陰性對照：以健康的桃樹葉片DNA為模板。陽性對照；以攜帶有桃樹黃化植原體16SrDNA序列的質(zhì)粒為模板。PCR反應(yīng)的空白對照；以水代替DNA模板。D.2.3PCR的反應(yīng)參數(shù)R16F2n/R16R2;94℃/2min;94℃/1min,60℃/30S.72℃/1mi個循環(huán)；72℃10min。D.3瓊脂糖凝膠電泳制備1%的瓊脂糖凝膠，以DNAMarker作為相對分子質(zhì)量標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。D.4序列測定序列如下：5'-GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGCTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCGGGAAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGAAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCTCACCAGGTCTTGACATAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGTTGTCCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGCGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATAAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTTTTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGAAGTCTGCAACTCGACTTCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTT