植物病毒檢測(cè)規(guī)范

植物病毒檢測(cè)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了取樣、運(yùn)輸和接收、檢測(cè)人員、儀器設(shè)備、藥品試劑，檢測(cè)方法、樣品、毒源的制備與保存等方面的要求和規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出境植物及其產(chǎn)品中病毒的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，僅注目期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單》適用于本文件。GB/T27402實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范植物檢疫SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T1840植物病毒免疫電鏡檢測(cè)方法SN/T2122進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。植物病毒plantvirus一類由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成的具有侵染活性的細(xì)胞內(nèi)寄生病原物。植物受病原物或不良環(huán)境因素的侵?jǐn)_后，內(nèi)部的生理活動(dòng)、外觀和生長(zhǎng)發(fā)育所顯示的某種異常狀態(tài)。用來(lái)鑒別病毒或病毒林系的植物，所產(chǎn)生的特征性癥狀可用來(lái)區(qū)分植物上常見的病毒。用一定的方法從大批物料中取出少量有代表性物料的過(guò)程。是國(guó)家植物檢疫機(jī)關(guān)按照有關(guān)檢疫規(guī)定，在指定的場(chǎng)所對(duì)進(jìn)出境植物種子、苗術(shù)及其他繁殖材料，實(shí)施隔離試種、觀察、檢疫和處理的過(guò)程。空白對(duì)照blank不給予任何處理的對(duì)照。8目標(biāo)條帶序列長(zhǎng)度一致，則判定檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性：如該樣品無(wú)特異性擴(kuò)增條帶，則判定檢測(cè)結(jié)果呈陰性。9.4.7.2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果判定在陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照均正常的情況下；結(jié)果判定根據(jù)樣品Ct值進(jìn)行判定，如Ct值是否在標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值范圍內(nèi)，判定為陽(yáng)性或陰性。檢測(cè)樣品信噪比值介于陰性對(duì)照信噪比值和陽(yáng)性質(zhì)控信噪比值之間為可疑陽(yáng)性，需要采用其他檢測(cè)方法加以驗(yàn)證。9.4.7.3基因芯片檢測(cè)結(jié)果判定檢測(cè)樣品信噪比值大于或等于陽(yáng)性質(zhì)控信噪比值檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性；檢測(cè)樣品信噪比值小于陰性對(duì)照信噪比值檢測(cè)結(jié)果判定為陰性。檢測(cè)樣品信噪比值介于陰性對(duì)照信噪比值和陽(yáng)性質(zhì)控信噪比值之間為可疑陽(yáng)性，需要采用其他檢測(cè)方法加以驗(yàn)證。9.4.7.4測(cè)序檢測(cè)結(jié)果判定將測(cè)序得到的核苷酸序列與已知的該物種特異性標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，如果同源性符合種內(nèi)判別標(biāo)準(zhǔn)，則判定檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，如果不符合種內(nèi)同源性判別標(biāo)準(zhǔn)，則判定檢測(cè)結(jié)果呈陰性。9.5結(jié)果綜合判定同時(shí)符合血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，血清學(xué)檢測(cè)和整別寄主鑒定結(jié)果為陽(yáng)性，血清學(xué)檢測(cè)方法中EI.ISA檢測(cè)和免疫電鏡兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的，可判定待檢測(cè)樣品帶有目標(biāo)病毒。10檢測(cè)過(guò)程中的防擴(kuò)散措施和防污染措施10.1防擴(kuò)散措施在病毒檢測(cè)全過(guò)程中均要防止病毒的擴(kuò)散。在取樣時(shí)應(yīng)用密閉裝，防止所取樣樣品在傳遞過(guò)程中散失遺漏：檢測(cè)后的余樣，如發(fā)現(xiàn)有檢疫性病毒的應(yīng)要燒毀，或高壓消毒，以防止病毒隨余樣進(jìn)行擴(kuò)散：對(duì)檢測(cè)后的洗滌液、玻璃器皿等要進(jìn)行高壓滅菌處理。10.2防污染措施對(duì)病毒檢測(cè)全過(guò)程均要建立防污染措施。要定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室中的微生物進(jìn)行監(jiān)控，定期用紫外光進(jìn)行處理，防止空氣中的病毒核酸氣溶膠對(duì)檢測(cè)結(jié)果的污染。10.3隔離檢疫溫室防污染措施定期對(duì)隔離檢疫溫室噴灑殺蟲劑或開啟紫外線燈照射消毒。進(jìn)入隔離檢疫溫室前應(yīng)銑手，在緩沖室內(nèi)更換工作服、帽、鞋，并且只能在隔離檢疫溫室內(nèi)使用10.4試驗(yàn)用品消毒對(duì)檢測(cè)過(guò)程所需的器皿及器械雷經(jīng)高溫濕熱滅菌或高溫干熱滅菌或高溫濕熱滅菌，在使用過(guò)程中避免交叉污染。所需的水以及試劑能滅菌處理的需經(jīng)滅菌處理。開封啟用過(guò)的無(wú)菌物品應(yīng)滅菌后使用；無(wú)菌物品應(yīng)分類故置，并定期檢查。11.1隔離檢疫記錄檢測(cè)人員在檢疫過(guò)程中詳細(xì)填寫檢疫記錄，每項(xiàng)檢測(cè)完成出具隔離檢疫實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。(資料性附錄)A.1當(dāng)陽(yáng)性樣品孔有顏色反應(yīng)，陰性對(duì)照孔無(wú)顏色反應(yīng)，且陰性對(duì)照孔OD值小于0.15,如果小于0.05按0.05計(jì)算，且重復(fù)檢測(cè)樣品OD值平行允許率(A)小于20%時(shí)則判定檢測(cè)結(jié)果有效。計(jì)算待測(cè)樣品OD值和剛性對(duì)照OD值之比值(P/N)。若P/N大于2,血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果判定值接近2.需重復(fù)檢測(cè)可疑樣品(如果