（正式版）QBT 8036-2024 乳制品中乳糖的測(cè)定 核磁共振波譜法

ICS67.050CCSX04QBQB/T8036—2024Determinationoflactoseindairyproducts—Nuclearmagneticresonance2024-03-29發(fā)布2024-10-01實(shí)施IQB/T8036—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中國(guó)輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。本文件由全國(guó)特殊食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC466）歸口。本文件起草單位：中輕技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司、中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、中輕檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、泉州市從心食品科技有限公司、中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所、北京大學(xué)、武漢中科牛津波譜技術(shù)有限公司、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)、方圓標(biāo)志檢驗(yàn)檢測(cè)（山東）有限公司、信陽(yáng)師范學(xué)院、首都師范大學(xué)、天津科技大學(xué)、安徽國(guó)泰眾信檢測(cè)技術(shù)有限公司、北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所有限公司、合肥德克斯低溫技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：鐘其頂、武竹英、樊雙喜、劉英濤、向俊鋒、張永章、扶暉、羅歡、張家海、盛建偉、周秋菊、李中峰、陳楠楠、張祎迒、陳洪周、吳一凡、王雨松、劉一諾、馮翠萍、崔潔、劉永成、張秀、崔亞娟、董邦勝。本文件為首次發(fā)布。2QB/T8036—2024乳制品中乳糖的測(cè)定核磁共振波譜法本文件描述了乳制品中乳糖含量的核磁共振波譜檢測(cè)方法。本文件適用于液體乳、奶片、奶酪、乳粉中乳糖的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法JY/T0578超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜測(cè)試方法通則JJF1448超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀校準(zhǔn)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理在合適的測(cè)試條件下，一維核磁共振波譜峰面積與樣品中所對(duì)應(yīng)的自旋核的數(shù)目成正比，同時(shí)，基于核磁共振信號(hào)強(qiáng)度（峰面積）互易原理，即給定線圈中核磁共振信號(hào)強(qiáng)度與90°脈沖寬度成反比，分別測(cè)定外標(biāo)參考物質(zhì)和待測(cè)樣品的一維核磁共振氫譜（1HNMR）及90°脈沖寬度，外標(biāo)法測(cè)定樣品中乳糖的含量。5試劑和材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。5.1試劑5.1.1重水（D2O）：純度≥99.8%。5.1.23-（三甲基硅烷基）氘代丙酸鈉[(CH3)3SiCD2CD2CO2Na，TSP-d4]。5.1.3疊氮化鈉（NaN3）。5.1.4濃鹽酸（HCl）。5.1.5氫氧化鈉（NaOH）。5.2溶液配制5.2.1TSP-d4重水溶液（10g/L）：稱(chēng)取TSP-d4（5.1.2）0.5g（精確至0.1mg）和疊氮化鈉（5.1.3）5mg（精確至0.1mg），用重水（5.1.1）溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容至刻度。5.2.2鹽酸（2mol/L）：量取濃鹽酸（5.1.4）16.8mL，用水稀釋并定容至100mL，臨用現(xiàn)配。5.2.3氫氧化鈉溶液（2mol/L)：稱(chēng)取氫氧化鈉（5.1.5）40g（精確至1mg用水溶解后，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，定容至刻度，臨用現(xiàn)配。5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1檸檬酸（C?H?O?,CAS號(hào)：77-92-9）純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)品。5.3.2乳糖（C12H22O11，CAS號(hào)：63-42-3）純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)品。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3QB/T8036—20245.4.1檸檬酸外標(biāo)溶液（2g/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取檸檬酸（5.3.1）0.20g（精確至0.1mg），用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度。于4℃冰箱密封保存，有效期1個(gè)月。5.4.2乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（51.2g/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取乳糖（5.3.2）5.12g（精確至1mg），用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度，臨用現(xiàn)配。5.4.3乳糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.4.2）5mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后得到25.6g/L的乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用以上相同方法，分別得到12.8g/L、6.4g/L、3.2g/L、1.6g/L、0.8g/L、0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。可根據(jù)樣品中乳糖含量適當(dāng)調(diào)整乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度范圍及乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度。6儀器設(shè)備6.1核磁共振波譜儀：氫（1H）共振頻率不低于400MHz；控溫精度不低于±0.1K。應(yīng)按照J(rèn)JF1448的規(guī)定對(duì)1H譜靈敏度、1H譜分辨力、1H譜線型、1H譜定量重復(fù)性進(jìn)行校準(zhǔn)。6.2核磁共振樣品管：外徑5mm，同心且均勻；或由核磁共振波譜儀廠商提供、指定樣品管。6.3分析天平：感量為0.1mg和1mg。6.4磁力攪拌器。6.5pH計(jì)：分辨力為0.01。6.6移液器：量程為10μL~100μL和100μL~1000μL。6.7濾膜：0.45μm水相膜。6.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8000r/min。7分析步驟7.1上機(jī)樣品制備7.1.1樣品處理稱(chēng)取液態(tài)樣品10.0g或固態(tài)樣品1.0g（精確至1mg）加入35mL水溶解，轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中，于磁力攪拌器（6.4）上攪拌30min，用鹽酸（5.2.2）或氫氧化鈉溶液（5.2.3）調(diào)pH至4.4~4.5，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。取5mL定容后的溶液于10mL離心管中，以8000r/min離心10min，取中間澄清溶液，使用0.45μm水相膜（6.7）過(guò)濾，取540μL濾液于核磁管中，加入60μLTSP-d4重水溶液（5.2.1），混勻，待測(cè)。7.1.2標(biāo)準(zhǔn)樣品配制分別取900μL檸檬酸外標(biāo)溶液（5.4.1）和乳糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.4.3），分別加入100μLTSP-d4重水溶液（5.2.1），渦旋振蕩1min，各取600μL分別于核磁管中，待測(cè)。7.2核磁共振分析參考條件7.2.1樣品管不旋轉(zhuǎn)。7.2.2檢測(cè)溫度：（300.0±0.1）K。7.2.3空掃次數(shù)：4次。7.2.4掃描次數(shù)：64次。7.2.5譜寬：8000Hz。7.2.6采樣點(diǎn)數(shù)：65536。7.2.7接收增益：16。7.2.8弛豫延遲時(shí)間：≥4s。7.2.9水峰壓制脈沖序列：預(yù)飽和加相位循環(huán)。7.3儀器校準(zhǔn)必要時(shí)，按照J(rèn)Y/T0578的規(guī)定對(duì)探頭溫度進(jìn)行校準(zhǔn)。7.4核磁共振測(cè)定步驟4QB/T8036—20247.4.1將裝有上機(jī)樣品的樣品管置于核磁共振波譜儀檢測(cè)腔內(nèi)，設(shè)置樣品管不旋轉(zhuǎn)。7.4.2設(shè)置待測(cè)樣品溫度為300.0K，測(cè)樣前應(yīng)等待至少5min至儀器溫度穩(wěn)定。7.4.3新建氫譜標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)文件。7.4.4鎖場(chǎng)與調(diào)諧。7.4.5勻場(chǎng)。7.4.6測(cè)定樣品的90°脈沖寬度，并記錄結(jié)果。7.4.7調(diào)用預(yù)飽和加相位循環(huán)的水峰壓制脈沖序列。7.4.8根據(jù)前述（7.2）要求設(shè)定空掃次數(shù)、掃描次數(shù)、譜寬、采樣點(diǎn)數(shù)、接收增益、弛豫延遲時(shí)間，設(shè)定90°脈沖寬度為前述測(cè)定值（7.4.6），根據(jù)水峰壓制效果優(yōu)化水峰壓制位置、壓制功率等，各樣品測(cè)試時(shí)保持接收機(jī)增益值一致，可根據(jù)樣品濃度優(yōu)化掃描次數(shù)。7.4.9采集核磁共振水峰壓制1H譜信號(hào)。7.4.10保存儀器所測(cè)譜圖，并記錄儀器狀態(tài)和測(cè)量數(shù)據(jù)。7.5校正因子（CF）的計(jì)算將裝有標(biāo)準(zhǔn)樣品的核磁管置于核磁共振波譜儀檢測(cè)腔內(nèi)。根據(jù)前述（7.2）要求設(shè)定儀器條件，根據(jù)前述（7.4）步驟進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得樣品和外標(biāo)的定量峰積分面積和積分區(qū)域?qū)?yīng)的氫原子數(shù)量，用計(jì)算所得上機(jī)樣品中乳糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，乳糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.4.3）濃度為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸方程y=ɑx+β,以線性回歸方程的斜率ɑ作為校正因子（CF）。7.6樣品的測(cè)定將裝有待測(cè)樣品的核磁管置于核磁共振波譜儀檢測(cè)腔內(nèi)。根據(jù)前述（7.2）要求設(shè)定儀器條件，根據(jù)前述（7.4）步驟進(jìn)行操作。測(cè)得樣品和外標(biāo)的定量峰積分面積和積分區(qū)域?qū)?yīng)的氫原子數(shù)量，根據(jù)校正因子（CF）計(jì)算得到待測(cè)樣品中乳糖的濃度。8數(shù)據(jù)處理8.1數(shù)據(jù)預(yù)處理將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行傅立葉變換、相位校正和基線校正，以TSP-d4中硅烷甲基的化學(xué)位移作為零點(diǎn)進(jìn)行定標(biāo)。8.2定性分析將乳糖和外標(biāo)物檸檬酸的1HNMR譜（見(jiàn)附錄A）信號(hào)峰進(jìn)行歸屬，得到乳糖和外標(biāo)物檸檬酸的定量相關(guān)參數(shù)（見(jiàn)附錄B）。8.3定量峰積分根據(jù)定性分析（8.2）得到的定量相關(guān)參數(shù)，確定外標(biāo)物檸檬酸和乳糖的定量峰積分面積。9分析結(jié)果的表述9.1上機(jī)樣品中乳糖的濃度按式（1）計(jì)算:s××××××ML·········································(1)式中：cs——上機(jī)樣品中乳糖的濃度，單位為毫克每升（mg/L）；cQ——外標(biāo)物檸檬酸溶液的質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/LMQ——外標(biāo)物檸檬酸的摩爾質(zhì)量，MQ=192.14g/mol；As——乳糖的定量峰積分面積；AQ——外標(biāo)物檸檬酸的定量峰積分面積；HQ——外標(biāo)物檸檬酸積分區(qū)域?qū)?yīng)的氫原子數(shù)量；5QB/T8036—2024Hs——乳糖積分區(qū)域?qū)?yīng)的氫原子數(shù)量；NQ——檸檬酸外標(biāo)溶液的上機(jī)掃描次數(shù)；Ns——上機(jī)樣品的上機(jī)掃描次數(shù)；Ps——上機(jī)樣品的1H90°脈沖寬度；PQ——外標(biāo)物檸檬酸的1H90°脈沖寬度；Ts——上機(jī)樣品的檢測(cè)溫度，單位為開(kāi)爾文（K）；TQ——檸檬酸外標(biāo)溶液的檢測(cè)溫度，單位為開(kāi)爾文（KML——乳糖的摩爾質(zhì)量，ML=342.30g/mol。計(jì)算結(jié)果保留兩位小數(shù)。9.2樣品中乳糖的含量按式（2）計(jì)算:式中：w——樣品中乳糖的含量，單位為克每千克（g/kg）；cs——式（1）計(jì)算得到的乳糖濃度，單位為毫克每升（mg/LV——樣品的定容體積，單位為毫升（mL）；ms——樣品的質(zhì)量，單位為克（g1000——換算系數(shù);CF——校正因子。計(jì)算結(jié)果保留一位小數(shù)。10精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的10%。當(dāng)樣品為固體，本方法的檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；當(dāng)樣品為液體，本方法的檢出限為0.03g/kg