實驗大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化

關于實驗大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化內容一：大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗目的實驗原理實驗儀器、材料、試劑實驗步驟

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4注意事項思考題

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6第2頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗目的

掌握感受態(tài)細胞的概念及其意義。

掌握感受態(tài)細胞的制備原理與操作方法。第3頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗原理感受態(tài)：受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實現其轉化的一種生理狀態(tài)。它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。制備感受態(tài)的細胞一般選擇對數生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉化的關鍵。常用的感受態(tài)制備方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因為操作簡便且符合大多數的分子克隆要求，因而被廣泛采用。第4頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

CaCl2

法的基本原理：細菌處于低溫（0℃）和低滲的CaCl2溶液中，菌體膨脹，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于菌體表面，在42℃進行短時間的熱激處理，促進DNA的吸收。實驗原理第5頁,共28頁，2024年2月25日，星期天CaCl2

法簡便易行，用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞，可使每微克超螺旋質粒DNA產生5106-2107個轉化菌落。在實際工作中，每微克有105以上的轉化菌落足以滿足一般的克隆實驗。

制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃，可以保存半年。實驗原理第6頁,共28頁，2024年2月25日，星期天提高轉化效率要考慮幾個重要因素：實驗原理

1、細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經過多次轉接或儲于4℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。

細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時，細胞密度在5×107

個/ml左右。第7頁,共28頁，2024年2月25日，星期天2、質粒的質量和濃度：用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。

1ng的超螺旋態(tài)DNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。實驗原理第8頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

3、試劑的質量：所用的試劑，如CaCl2

等均需是最高純度的，并用超純水配制，并用微孔濾膜過濾滅菌，最好分裝保存于干燥的冷暗處。實驗原理第9頁,共28頁，2024年2月25日，星期天4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。實驗原理第10頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗儀器、材料、試劑1、儀器：高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、臺式

離心機、無菌操作臺、微量移液

器、恒溫搖床；2、材料：菌種E.coliDH5α；3、試劑：LB液體培養(yǎng)基、0.1MCaCl2。第11頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

1、將E.coliDH5α單菌落接種于3mlLB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2、取30μl液體培養(yǎng)液加入3mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下震蕩培養(yǎng)，至光密度值OD600在0.5~0.6之間（5×107

個/ml）。

3、取1mlE.coli液體培養(yǎng)液于1.5ml的離心管中，4000rpm，4℃離心3min。實驗步驟第12頁,共28頁，2024年2月25日，星期天4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰

冷的0.1MCaCl2溶液，使沉淀充分懸浮，動

作要輕柔，置于冰上30min，4000rpm，4℃離心3min。5、棄上清，加入lml凍存液（含15%甘油的0.1MCaCl2溶液）溶液，使沉淀充分懸浮，以每管0.1ml的規(guī)格分裝3管，凍存于-80℃，可保存4~6個月。實驗步驟第13頁,共28頁，2024年2月25日，星期天注意事項1、不要用經過多次轉接或儲存與4℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接

轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。2、細胞生長密度以剛進入對數生長期時為宜，可以通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600控制。DH5α菌株的OD600為0.5時，細胞密度比

較合適。密度過高或不足均會影響轉化

效率。第14頁,共28頁，2024年2月25日，星期天注意事項3、進行熱激制備感受態(tài)細胞時要控制好

時間。4、懸浮細胞時動作要輕柔，以免造成菌

體破裂，影響轉化。第15頁,共28頁，2024年2月25日，星期天思考題1、影響感受態(tài)細胞轉化效率的因素有哪

些？第16頁,共28頁，2024年2月25日，星期天內容二：質粒DNA的轉化與轉化體篩選實驗目的實驗原理實驗儀器、材料、試劑實驗步驟

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4注意事項思考題

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6第17頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗目的了解轉化的概念及其在分子生物學研究中

的意義。學習將外源質粒DNA轉入受體菌細胞及篩

選重組子的方法。第18頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗原理轉化：指質粒DNA或以它為載體構建的重組DNA導入細菌細胞，并使其生物學特性發(fā)生可遺傳的變化的過程，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。

第19頁,共28頁，2024年2月25日，星期天轉化的方法：

(1)化學的方法(熱激法)：使用化學試劑(如CaCl2)制備的感受態(tài)細胞，通過熱激處理將載體DNA分子導入受體細胞；

(2)電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。實驗原理第20頁,共28頁，2024年2月25日，星期天用CaCl2處理大腸桿菌細胞使其處于感受態(tài)后，通過熱激處理可將質粒轉化進入細菌中。進入細菌細胞的質粒能夠自主復制并在宿主中實現其攜帶基因的轉錄、表達。實驗原理第21頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗原理第22頁,共28頁，2024年2月25日，星期天轉化體的篩選方法：主要用不同抗生素基因篩選。

常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。實驗原理第23頁,共28頁，2024年2月25日，星期天如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。將經過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。實驗原理第24頁,共28頁，2024年2月25日，星期天本實驗使用的pGEX-4T-2質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp)，理論上只有轉入了質粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基生長。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉進質粒的細菌能在抗性培養(yǎng)基上生存（假陽性），因此還需要通過提取質粒酶切、電泳作進一步的鑒定。實驗原理第25頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗儀器、材料、試劑1、儀器：恒溫搖床，恒溫水浴鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，無菌工作臺，微量移液槍。2、材料：DH5α感受態(tài)細胞、質粒pGEX-4T23、試劑：LB液體及固體培養(yǎng)基、氨芐青霉

素Amp（50mg/ml）。第26頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟1、每100ul感受態(tài)細胞加入1ul質粒DNA，

同時做一個空白對照（由第一組完成）