HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南

HIV-1HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南#HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南（2013版）GuidelineforHIV-1ViralLoadTestingandQualityAssurance中國疾病預(yù)防控制中心2013年1月前言隨著HIV-1病毒載量檢測在艾滋病臨床輔助診斷、抗病毒治療監(jiān)測及相關(guān)科研工作中的廣泛應(yīng)用，我國開展該項檢測工作的實驗室日益增多。自1997年艾滋病實驗室首次引進HIV-1病毒載量檢測技術(shù)以來，截至2012年底全國已經(jīng)配備115臺HIV-1病毒載量檢測儀，覆蓋疾控、醫(yī)院、檢疫、軍隊等系統(tǒng)，艾滋病流行重點地區(qū)及少數(shù)縣級實驗室均已配備HIV-1病毒載量檢測儀，每年檢測量已達13萬人份以上。由于HIV-1病毒載量檢測質(zhì)量對艾滋病的早期診斷及治療有重要影響，因此急需加強該領(lǐng)域的培訓和質(zhì)量控制，規(guī)范實驗室操作，以保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性。自2008年開始實施《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》（試行，以下簡稱《指南》）以來，參與HIV-1病毒載量能力驗證工作的實驗室從2007年的29家增加到2012年的107家，占已開展工作實驗室的百分之九十以上。通過綜合分析近幾年能力驗證發(fā)現(xiàn)的問題與檢測技術(shù)發(fā)展的實際情況，考慮各種試劑的檢測要求，結(jié)合專家意見和一線實驗室工作人員的經(jīng)驗與需求，對本指南進行了適當修改、調(diào)整和補充，主要修改內(nèi)容包括：（1）增加“人員要求”章節(jié)；（2）修改“常用HIV-1病毒載量檢測方法”；（3）修改“HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）”；（4）補充常見問題分析和處理等內(nèi)容。修訂后的《指南》共分八章，包括：總則，人員要求，實驗室環(huán)境與設(shè)施，樣品的采集、處理保存運輸，常用檢測方法簡介，室內(nèi)質(zhì)量控制，實驗室檢測能力驗證（PT），實驗室生物安全，以及四個附表。本指南在修改過程中，接納了國內(nèi)專家、同行的意見和建議，經(jīng)過多次修改編寫成《指南》（2013）版。本指南由中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心艾滋病參比實驗室組織有關(guān)專家撰寫，由中國疾病預(yù)防控制中心批準執(zhí)行，并在HIV-1病毒載量檢測實驗室網(wǎng)絡(luò)內(nèi)發(fā)布實施。由于國內(nèi)各實驗室條件不同，不能采納所有實驗室的建議，因此本指南主要提出一些原則上的參考建議，其中定有不妥之處，希望廣大同仁提出意見，以便不斷完善。本指南在2008年頒布的《指南》（試行）的基礎(chǔ)上修訂，在此對編寫試行版過程中給予幫助的國際組織和專家表示感謝。對本次修訂過程中提出建議的全國HIV-1病毒載量檢測實驗室基層工作人員表示衷心的感謝。本指南的解釋權(quán)屬于中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心。本指南編寫主持人：蔣巖本指南編寫人員：潘品良蔣巖李敬云鐘平尚紅李太生李繁本指南審核咨詢專家及技術(shù)人員：邵一鳴汪寧王佑春郭志宏肖瑤邱茂鋒邢文革姚均朱紅秦光明徐建青本指南編寫聯(lián)系人：潘品良本指南適用于全國HIV-1病毒載量檢測實驗室本指南編寫單位：中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心本指南自發(fā)布之日實施，同時終止2008年頒布的《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》（試行）。HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南目錄第一章總則第二章人員要求第三章實驗室環(huán)境與設(shè)施第四章樣品的采集、處理、保存、運輸?shù)谖逭鲁Ｓ脵z測方法簡介第六章室內(nèi)質(zhì)量控制第七章實驗室檢測能力驗證（PT）第八章實驗室生物安全附表1常見問題分析和處理附表2HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單附表3HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單附表4HIV-1病毒載量檢測報告單參考文獻縮略語第一章總則意義HIV-1病毒載量是指每毫升血漿中病毒顆粒的數(shù)量，是艾滋病防治工作中一項重要的實驗室檢測指標。HIV-1病毒載量檢測主要用于抗病毒治療監(jiān)測，包括治療時機判定、治療效果評估、耐藥預(yù)警；還可用于HIV感染的輔助診斷，包括窗口期、病程晚期、嬰兒感染、疑難樣本等的診斷；也可用于血液篩查。為了保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性，必須對開展HIV-1病毒載量檢測的實驗室進行規(guī)范化管理和質(zhì)量控制。目的指導HIV-1病毒載量檢測工作，規(guī)范實驗室質(zhì)量控制與管理。適用范圍適用于我國開展HIV-1病毒載量檢測工作的所有實驗室。第二章人員要求HIV-1病毒載量檢測人員分為檢驗人、復(fù)核人、簽發(fā)人。培訓實驗室在使用新方法前，須對技術(shù)人員進行上崗培訓，獲得資格后方可開展相應(yīng)工作。上崗培訓內(nèi)容至少應(yīng)包括：HIV檢測相關(guān)基礎(chǔ)知識，HIV-1病毒載量檢測技術(shù)及管理要求，實驗操作，質(zhì)量保證與質(zhì)量控制，生物安全。檢驗人進行HIV-1病毒載量檢測的人員須具有艾滋病檢測實驗室的上崗資格，接受過省級以上的實驗操作技術(shù)及艾滋病實驗室生物安全培訓及廠家的技術(shù)操作培訓。所有相關(guān)檢驗人員需經(jīng)公司工程師操作培訓，能獨立熟練地操作，并經(jīng)考核合格，持證上崗。復(fù)核人、簽發(fā)人應(yīng)具備對檢測過程進行分析、解決問題的能力。復(fù)核人負責對原始數(shù)據(jù)查閱、結(jié)果核對，簽發(fā)人核實結(jié)果正確后對外簽發(fā)報告。第三章實驗室環(huán)境與設(shè)施除了HIV-1病毒載量檢測儀器，合理地、充分地配備實驗室環(huán)境、設(shè)施、輔助設(shè)備是保證HIV-1病毒載量檢測質(zhì)量的重要方面。實驗室環(huán)境HIV-1病毒載量實驗室應(yīng)符合分子生物學實驗室基本要求，包括試劑準備區(qū)、樣品處理區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。實驗室設(shè)置總體原則為各區(qū)獨立、控制風向、因地制宜、方便工作。具體要求：各區(qū)必須是相互獨立的，有條件各區(qū)內(nèi)可分別設(shè)置緩沖間，以保證不同區(qū)之間完全分隔開。各區(qū)的儀器設(shè)備與各種物品必須為專用，避免交叉污染。試劑準備區(qū)和樣品處理區(qū)內(nèi)須保持低度正壓（或常壓）狀態(tài)，使空氣流向始終由室內(nèi)向外，以避免擴增污染物進入此區(qū)域。擴增產(chǎn)物分析區(qū)內(nèi)須保持低度負壓狀態(tài)，使空氣流向始終由室外向內(nèi)，以防止擴增產(chǎn)物通過氣溶膠流出，造成與其他區(qū)域的交叉污染。實驗室可安裝排風扇或其他排風裝置。擴增產(chǎn)物分析區(qū)可以設(shè)在遠離其他各區(qū)的地方。工作時必須遵循單一工作流向，即只能從試劑準備區(qū)開始，到樣品處理區(qū)，然后到擴增產(chǎn)物分析區(qū)。實驗室設(shè)施各種HIV-1病毒載量檢測方法除病毒載量檢測儀外，還需要配備相應(yīng)的輔助設(shè)備才能完成檢測。HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖提供為HIV-1病毒載量檢測實驗室不同區(qū)內(nèi)必備的輔助設(shè)備及耗材。輔助設(shè)備應(yīng)根據(jù)不同檢測方法作相應(yīng)變化。樣品處理區(qū)：生物安全柜：二級離心機（32000g，適合1.5mL離心管）冰箱：2-8℃，-20℃，-70℃以下水浴箱：誤差范圍小于0.5℃加樣器1套（20μL、200μL、1000μL）

帶濾芯的一次性吸頭（無DNA和RNA酶），1.5mL離心管（無DNA和RNA酶）及相應(yīng)試管架計時器旋渦振蕩器：震動頻率可調(diào)一次性工作服、帽、口罩、無粉手套和鞋套HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖病毒載量儀

加樣器生物安全柜

加樣器超凈工作臺

加樣器帶濾芯的一次性吸頭（無DNA和RNA酶），1.5mL離心管（無DNA和RNA酶）及相應(yīng)試管架計時器旋渦振蕩器：震動頻率可調(diào)一次性工作服、帽、口罩、無粉手套和鞋套HIV-1病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布示意圖病毒載量儀

加樣器生物安全柜

加樣器超凈工作臺

加樣器擴增產(chǎn)物分析區(qū)漩渦振蕩器漩渦振

蕩器冰

箱2-8℃樣品處理區(qū)注:箭頭表示風的流動方向冰箱-70℃冰箱-20℃冰

箱2-8℃試劑準備區(qū)試劑準備區(qū)：超凈工作臺（或密閉工作臺）加樣器1套（20μL、200μL、1000μL）離心機（18000g，適合1.5mL離心管）冰箱：2-8℃，-20℃計時器旋渦振蕩器，震動頻率可調(diào)帶濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）1.5mL離心管（無DNA和RNA酶）及相應(yīng)試管架一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套擴增產(chǎn)物分析區(qū)：HIV-1病毒載量檢測儀加樣器1套（20μL、200μL、1000μL）冰箱：2-8℃，-20℃旋渦振蕩器，震動頻率可調(diào)一次性工作服、帽、口罩、無粉手套和鞋套帶濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）第四章樣品的采集、處理、保存和運輸樣品的采集、處理、保存和運輸要求保證滿足不同HIV-1病毒載量檢測方法對樣品性質(zhì)的，并保證生物安全。因此需按照所使用檢測方法的要求嚴格執(zhí)行抗凝、分樣時間、運輸包裝、保存溫度、凍融記錄。用于HIV-1病毒載量檢測的樣品須采用抗凝血漿。樣品的采集采樣器材：一次性抗凝真空采血管、持針器、蝶形針等。抗凝劑：通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸櫞酸鈉），須符合不同檢測方法對樣品的要求。樣品標識：在采血管上貼唯一性樣品編號。樣品采集量：通常采集全血8-10ml,采集的樣品量應(yīng)與定量采血管的刻度要求一致，避免血液凝固或稀釋。樣品混勻：采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管10次，使血液與抗凝劑充分混勻。其它信息：HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）的備注欄內(nèi)需注明采集對象的基本信息和流行病學資料、抗病毒藥物使用情況、最近一次的實驗室病毒載量檢測結(jié)果。樣品的處理要求在采血后6小時內(nèi)離心樣品，室溫下使用離心力為800-1200g（1500-3000rpm）離心10分鐘后，吸出血漿,分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中，并注明分裝時間，凍存管應(yīng)提前貼上耐凍的樣品編號標簽。血漿樣品不能滅活。做好樣品處理記錄，包括冰箱溫度變化、樣品存取。樣品的保存保存條件：根據(jù)血漿檢測時間而定，4天內(nèi)可在4℃暫時保存，3個月內(nèi)應(yīng)凍存于-20℃以下，3個月以上應(yīng)置于-70℃以下。不能使用自動除霜冰箱。血漿樣品凍融不應(yīng)超過3次。監(jiān)控并記錄保存溫度以及樣品狀態(tài)的變化防止樣品變質(zhì)、泄漏及污染。樣品的運輸根據(jù)《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》的要求運輸，并嚴格控制運輸?shù)睦鋬鰻顟B(tài)，避免樣品融化。樣品的發(fā)送和接收發(fā)送樣品時,需詳細填寫樣品HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）。接收樣品時，按HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）核對樣品數(shù)量，檢查樣品狀況。樣品管破損造成樣品溢出、出現(xiàn)明顯溶血、凝血的樣品，不宜作HIV-1病毒載量檢測；如果樣品已經(jīng)融化，可以4℃保存并盡快檢測，記錄凍融一次。第五章常用檢測方法簡介HIV-1病毒載量檢測根據(jù)方法的原理不同，分為不同系列儀器，目前常用的HIV病毒載量的測定方法有：核酸序列依賴性擴增(NASBA)技術(shù)，代表產(chǎn)品為實時熒光技術(shù)NucliSensEasyQ儀；分枝DNA信號放大系統(tǒng)(bDNA)技術(shù)，代表產(chǎn)品為bDNA440分析儀；實時熒光定量PCR擴增技術(shù)(real-timePCR)，包括CobasAmplicorTaqman檢測系統(tǒng)、M2000檢測儀與國產(chǎn)試劑盒均屬此類技術(shù)。5．1核酸序列依賴性擴增(NASBA)技術(shù)最早產(chǎn)品為NucliSensECL定量RNA測定方法，已經(jīng)被NucliSensEasyQ新一代實時分子信標定量擴增所取代。所采用的 NASBA技術(shù)是一種等溫擴增系統(tǒng)，其擴增基礎(chǔ)在于系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系統(tǒng)，此系統(tǒng)內(nèi)含有逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV-RT和T7-DNA多聚酶在體外模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)復(fù)制過程。NuclisensEasyQ結(jié)合NASBA技術(shù)、BOOM核酸提純技術(shù)與分子信標探針技術(shù)(MolecularBeacon)檢測血漿中的HIVRNA水平。這種結(jié)合方法使用實時擴增分析(real-timeamplificationassay)，提高對診斷質(zhì)量的要求。此方法可分為三個步驟：核酸提取、擴增和等溫檢測。NucliSensEasyQHIV-1的檢測是利用靶特異的分子信標進行，分子信標的DNA寡核苷酸片段包含一段可特異結(jié)合靶RNA的序列。當RNA互補鏈不存在時，分子信標維持內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使猝滅基團處于非常接近熒光素的位置，熒光信號被猝滅。當分子信標與互補靶序列結(jié)合，發(fā)夾打開釋放熒光信號，報告靶序列的存在。NucliSensEasyQHIV-1使用兩個不同的分子信標，一個是針對野毒株HIV-1RNA的擴增子，另一個針對內(nèi)標物RNA(calibrator)的擴增子，各使用不同熒光染料(野毒株使用6-FAM，內(nèi)標物使用6-ROX)，從而實現(xiàn)靶序列和內(nèi)標物RNA兩個擴增過程的各自跟蹤。熒光信號的動力學分析可以顯示野毒株和內(nèi)標物RNA的轉(zhuǎn)錄速率，因此可以計算出原樣本中HIV-1RNA含量。5．2分枝DNA(bDNA)技術(shù)分枝DNA測定技術(shù)基于其獨特的信號放大系統(tǒng)，即分枝DNA信號放大系統(tǒng)，為一個人工合成的分枝DNA，分枝DNA的分枝可結(jié)合多個酶標記物，從而將病毒的信號放大，以便進行檢測。此檢測系統(tǒng)不涉及核酸擴增反應(yīng)。方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標記物，每次實驗設(shè)置一系列外部標記，通過實驗樣品反應(yīng)強度與外部標記樣品強度的比較確定待檢樣品的病毒拷貝數(shù)。bDNA檢測通常包括以下步驟：（1）將患者血清或血漿連同含有特異的合成寡聚核苷酸靶探針的裂解液加到微孔中；（2）孵育，釋放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA變性,然后靶探針結(jié)合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷卻洗板；（4）加信號放大探針（bDNA）到各孔內(nèi)；（5）孵育，使bDNA雜交到靶探針的相應(yīng)部位；（6）冷卻洗板；（7）加標記探針到各孔內(nèi)；（8）孵育，使酶標記的探針雜交到bDNA上；（9）冷卻洗板；（10）加化學發(fā)光底物到各孔中；（11）孵育，酶和底物相互作用，產(chǎn)生化學發(fā)光信號。發(fā)射的光強以相對光量值（RLUs）表示。產(chǎn)生的光強直接與各樣品中病毒RNA或DNA的拷貝數(shù)成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一同處理的標準所制作的標準曲線計算獲得。bDNA440病毒載量檢測儀較bDNA340在孵育、沖洗和加樣步驟由手動操作轉(zhuǎn)變?yōu)樽詣踊?，減少污染，更便于操作節(jié)省實驗時間。5．3實時（real-time）熒光定量PCR擴增實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目標RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-timePCR，檢測PCR的產(chǎn)物使用熒光標記的寡核苷酸探針。檢測的原理基于熒光信號增長曲線與循環(huán)數(shù)相關(guān)。（3）RT-PCR反應(yīng)，病毒RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過DNA聚合酶對特定片段進行擴增。（4）擴增產(chǎn)物的檢測，基于檢測閾值的設(shè)定，當病毒載量高時，低循環(huán)數(shù)即能檢測到熒光信號，當病毒載量低時，高循環(huán)數(shù)時才能檢測到熒光。循環(huán)數(shù)與樣品病毒載量成線性關(guān)系。利用標準品制作循環(huán)數(shù)與病毒載量的標準曲線就能對樣品病毒載量進行定量檢測。目前此原理已為多種HIV-1病毒載量檢測的的主要方法，包括CobasAmplicorTaqman檢測系統(tǒng)、M2000檢測儀和國內(nèi)產(chǎn)品凱杰、達安以及正研制的定量檢測試劑均屬于該技術(shù)。CobasAmplicorTaqman檢測系統(tǒng)是全自動化的實時熒光定量PCR病毒載量平臺,具有樣品進--結(jié)果出(sample-in,result-out) 的特點。此方法的檢測過程為：裝待測樣品、放試劑和耗材、 核酸提取、PCR反應(yīng)體系制備、實時熒光定量PCR。Taqman熒光定量技術(shù)是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而實現(xiàn)定量。M2000利用RT-PCR法，在開始制備樣本時，對每個樣本加入與HIV-1目標序列無關(guān)的RNA序列。這種不相關(guān)的RNA序列通過RT-PCR被同時擴增，從而充當內(nèi)部質(zhì)控品(IC)。在m2000rt儀器上，每個擴增循環(huán)中存在的HIV-1目標序列總量通過含熒光標記的寡核苷酸探針測定。m2000rt系統(tǒng)通過樣品制備、試劑制備和反應(yīng)板裝置、擴增、檢測四個步驟，檢測到熒光信號的擴增循環(huán)與初始樣本中存在的HIV-1RNA濃度對數(shù)成比例。國內(nèi)產(chǎn)品匹基、達安試劑盒的原理步驟與上述類似，為開放式試劑，可以使用多款實時熒光定量PCR檢測儀。5．4不同方法檢測結(jié)果間相互關(guān)系病毒載量的檢測單位有拷貝數(shù)(CP)/ml和國際單位(IU)/ml，且同一樣本不同方法的病毒載量檢測結(jié)果不同，另外，不同方法間檢測結(jié)果并無固定的轉(zhuǎn)換關(guān)系，與病毒亞型、試劑不同版本有關(guān)，因此評估同一病人的治療效果需用同一種方法檢測，并且考慮試劑版本的更新情況。第六章室內(nèi)質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制是在良好實驗室整體環(huán)境支持下，從樣品接收到發(fā)出報告整個過程每個環(huán)節(jié)的管理過程，包括：（1）人員；（2）實驗室分區(qū)和環(huán)境；（3）儀器；（4）檢測過程（試劑、操作過程、質(zhì)控品使用）；（5）數(shù)據(jù)報告。人員HIV-1病毒載量檢測人員分為檢驗人、復(fù)核人、簽發(fā)人。所有相關(guān)檢驗人員需經(jīng)操作培訓，能獨立熟練地操作，并經(jīng)考核合格，持證上崗。復(fù)核人、簽發(fā)人應(yīng)具備對檢測過程進行分析、解決問題的能力。實驗室分區(qū)和環(huán)境實驗室分區(qū)的功能HIV-1病毒載量檢測實驗室原則上應(yīng)分為三個獨立工作區(qū)：試劑準備區(qū)、樣品處理區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)，并設(shè)在不同房間。不同檢測方法的分區(qū)功能和要求可有所不同。試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存；樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝，核酸提取、保存和加樣；擴增產(chǎn)物分析區(qū)：產(chǎn)物擴增的測定、結(jié)果分析、登記及報告。嚴格要求三區(qū)的單一空氣流向：從試劑準備區(qū)到樣品處理區(qū)，然后到擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不能逆向流動。實驗室的設(shè)置及輔助設(shè)備的具體要求參見第三章。實驗室環(huán)境的要求實驗室有足夠的空間；采光好，應(yīng)避免陽光直射設(shè)備；室溫控制在18~25℃；室內(nèi)相對濕度控制在30~70%；電源穩(wěn)定，HIV-1病毒載量檢測儀應(yīng)配備穩(wěn)壓電源；室內(nèi)保持干凈整潔，無灰塵；實驗前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸鈉及時處理操作臺面。儀器設(shè)備質(zhì)控加樣器、溫濕度計須經(jīng)計量部門校準，每年一次，每半年期間核查一次。HIV-1病毒載量檢測儀及其配套儀器可以委托公司校準，每年一次。離心機可以委托計量部門或公司校準，每年一次。冰箱、水浴箱用校準合格的溫度計測量溫度，每次做好記錄。檢測過程質(zhì)控試劑質(zhì)控使用經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊的試劑。所有試劑盒須嚴格按要求條件保存。試劑盒拆封時，要記錄拆封時間，所有試劑嚴格控制在有效期內(nèi)使用。實驗用水：要求使用無DNA和RNA酶的去離子水。操作過程質(zhì)控按照試劑盒要求與實驗室的條件及時更新標準操作程序（SOP），并嚴格執(zhí)行，不得擅自修改。質(zhì)控品的使用每次實驗按照試劑盒說明書的要求使用試劑盒提供的質(zhì)控品，并滿足質(zhì)控要求。同時使用外部質(zhì)控品（HIV病毒載量值為5000-15000拷貝/毫升質(zhì)控品），如果試劑盒沒有陰性質(zhì)控品，需加一個陰性質(zhì)控品。外部質(zhì)控品的制備、定值及使用（1）制備對用于制備質(zhì)控品的大樣本血漿樣品，要求用EDTA抗凝劑抗凝，新鮮抗凝血離心分離，得到透亮血漿。然后用孔徑為0.2微米的濾膜過濾除菌，充分混勻。按各自方法對樣品量的需求，用無菌凍存管定量分裝，標記，封口，凍存于-70℃以下非自動除霜冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。按實際使用量的要求配制足夠量外部質(zhì)控品（推薦每次配置量可使用兩年）。（2）定值從制備好的外部質(zhì)控品中隨機選出5管，嚴格按照實驗室的各自方法標準操作程序進行HIV-1病毒載量檢測，將測得結(jié)果的拷貝值或IU值換算成Log10值，計算其算術(shù)平均值（M）和標準偏差（S）。（3）質(zhì)控圖的繪制和使用根據(jù)測得值，在坐標圖上畫出平均值、±2S、±3S線圖，作質(zhì)控圖使用。每次檢測都應(yīng)帶一個外部對照，將得到的外部質(zhì)控品Log10值標在上述質(zhì)控圖上。每次質(zhì)控品測得值在平均值±2.0s內(nèi)方為有效。使用新批次的外部對照質(zhì)控品時，必須重新繪制質(zhì)控圖。（4）質(zhì)控品不宜使用稀釋方法制備。6.5數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告在試劑盒及外部質(zhì)控品結(jié)果滿足要求的前提下，對樣品進行分析。外部質(zhì)控品不合格，樣品需要重新檢測。結(jié)果超過檢測上限的樣品應(yīng)稀釋以后重新檢測。復(fù)核人對檢測結(jié)果進行仔細復(fù)核并對結(jié)果提出結(jié)論、簽字。簽發(fā)人對結(jié)果的結(jié)論進行審核、分析、總結(jié)、簽字。按不同方法的要求，以拷貝/毫升或國際單位/毫升為單位報告樣品的HIV-1病毒載量值。第七章實驗室檢測能力驗證（PT）HIV-1病毒載量檢測的外部質(zhì)量控制可以通過參加外部質(zhì)量評價，提高實驗結(jié)果的可比性，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差，改進實驗室工作，提高檢測質(zhì)量。HIV-1病毒載量檢測實驗室須參加艾滋病/丙肝參比實驗室或有資質(zhì)的國內(nèi)外機構(gòu)組織的HIV-1病毒載量檢測能力驗證來實施外部質(zhì)量控制。PT組織艾滋病/丙肝參比實驗室為HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的組織者，負責制定國內(nèi)HIV-1病毒載量檢測能力驗證的計劃并組織實施。國內(nèi)所有從事HIV-1病毒載量檢測的實驗室須參加該PT項目，在規(guī)定時間內(nèi)使用有效試劑與實驗樣品一起檢測，填寫HIV-1病毒載量檢測報告單（附表4），上報艾滋病/丙肝參比實驗室。鼓勵有條件的實驗室參加有資質(zhì)的國內(nèi)外機構(gòu)組織的PT活動。PT實施PT樣品組成：每次5份。包括陰性、不同拷貝數(shù)的陽性樣品?？梢愿鶕?jù)實驗室的考核目的制備考核盤。PT頻率：一年2次。PT樣品的接收與保存：要求參加PT的實驗室收到考核樣品后，立即進行核對、檢查，填寫HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單（附表3），3天內(nèi)傳回艾滋病/丙肝參比實驗室。如發(fā)現(xiàn)考核樣品缺失、量不足、空管等情況，及時書面回報，艾滋病/丙肝參比實驗室負責補寄或更換。收到樣品后應(yīng)及時檢測或在-70度以下保存。PT樣品的檢測：要求將考核樣品同實驗室常規(guī)樣品一起檢測，由常規(guī)檢測人員進行。PT結(jié)果的報告和處理：參加PT的實驗室必須在規(guī)定的時間內(nèi)，用電子郵件或書面報告實驗結(jié)果，并將HIV-1病毒載量實驗結(jié)果報告單和打印的儀器原始記錄一起上報給艾滋病/丙肝參比實驗室，艾滋病/丙肝參比實驗室將負責結(jié)果錄入和處理。有任何原因不能按時上報者，需有單位蓋章的書面申請。評分原則將參與實驗室反饋結(jié)果換算成對數(shù)值（Lg），再按同一種方法與同一個考核品的的所有實驗室結(jié)果進行統(tǒng)計，算出平均值（M）和標準偏差（S）。成績判定：根據(jù)每個參與考核實驗室一年兩次所有考核品的結(jié)果進行綜合評分（每一個考核品的評判標準依照與條款），判定標準為：優(yōu)秀：所有考核品沒有問題；良好：有一個考核品滿足中的條款；合格：兩個考核品滿足中的條款④不合格：至少有三個考核品滿足中的條款或至少一個考核品出現(xiàn)中的條款。樣品結(jié)果在M+2.0S～M+3.0S內(nèi)；樣品結(jié)果在M-2.0S～M-3.0S內(nèi)；考核結(jié)果報告沒及時上報；沒按要求上報原始記錄。樣品結(jié)果超過>M+3.0S；樣品結(jié)果<M-3.0S；假陽性；假陰性；無效結(jié)果。評估結(jié)果反饋：艾滋病/丙肝參比實驗室根據(jù)各實驗室的兩次考核結(jié)果，及時反饋每次評估結(jié)果。每年反饋最后的評估結(jié)果，并發(fā)證書。抱怨和申訴：參評實驗室如對評估結(jié)果或其它方面存有異議，可以在收到結(jié)果后10天內(nèi)向艾滋病/丙肝參比實驗室提出異議，后者在核實情況后予以答復(fù)?，F(xiàn)場督導：根據(jù)考核情況的需要，艾滋病/丙肝參比實驗室組成技術(shù)專家組對不合格實驗室進行現(xiàn)場檢查。檢查內(nèi)容包括：實驗原始數(shù)據(jù)、實驗室布局、儀器運行狀況、輔助設(shè)備校準狀況、實驗耗材質(zhì)量、樣品保存、試劑盒使用狀態(tài)、人員培訓狀況、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制等。給實驗室反饋督導報告，現(xiàn)場實驗室按相關(guān)建議作出整頓。第八章實驗室生物安全相關(guān)依據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《實驗室生物安全通用要求》、《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣品運輸管理規(guī)定》、《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理辦法》和《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》。安全細則進入實驗室應(yīng)穿工作服、戴口罩、戴一次性乳膠手套。嚴禁在實驗室內(nèi)進食、飲水和吸煙以及使用化妝品。所有樣品包括試劑盒中的人源性成份（如陰、陽性對照）都應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進行處理。樣品應(yīng)盛裝在有螺旋蓋的離心管中，以防樣品濺出或產(chǎn)生交叉污染。當具有潛在傳染性的物質(zhì)溢出時，立即用0.1%次氯酸鈉溶液或其它消毒劑處理污染區(qū)及器材；接觸過標本的耗材應(yīng)置有專用消毒劑的容器，與一次性物品一起在丟棄前進行高壓滅菌處理。避免試劑盒中各種有毒有害化學成分（如疊氮鈉、二甲基亞砜、異硫氰酸胍）對人體或環(huán)境可能造成的危害。8.3生物安全培訓所有涉及HIV-1病毒載量檢測的人員都應(yīng)經(jīng)過嚴格的安全培訓，要掌握生物安全保障的原則、措施。每個人的安全教育均應(yīng)記錄在實驗室和人事檔案中。省級及以上疾控中心艾滋病實驗室負責HIV/AIDS檢測生物安全培訓及HIV-1病毒載量檢測培訓。檢測相關(guān)人員應(yīng)主動接受實驗室生物安全員以及安全負責人的監(jiān)督。所有實驗室意外事件均應(yīng)進行記錄和報告。所有人員要保護自身和環(huán)境的安全。參照實驗室安全指南和標準操作程序的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行具體操作。職業(yè)暴露處理實驗室應(yīng)建立完善的艾滋病職業(yè)暴露后的預(yù)防機制。發(fā)生職業(yè)暴露后，首先進行應(yīng)急處理，然后根據(jù)暴露級別和暴露源頭嚴重程度，評估風險級別，并決定是否進行預(yù)防性用藥和用藥程序，如需要時，盡早開始服用抗病毒藥物。按規(guī)定進行職業(yè)暴露登記、檢測和報告，注意做好保密工作。

附表1常見問題分析一）EasyQ問題（出現(xiàn)錯誤代碼）處理方法錯誤代碼1：未檢測到信標嚴格按標準操作步驟執(zhí)行（如樣本裂解、酶溶解要充分）錯誤代碼2：內(nèi)標數(shù)據(jù)與野生型數(shù)據(jù)不符由公司工程師解決軟件收集數(shù)據(jù)出錯誤代碼3：曲線中斷使用穩(wěn)壓電壓錯誤代碼4：無擴增a、標本中有嚴重的溶血、脂血和纖維蛋白或一些未知的抑制因子,渾濁標本，檢測前離心樣品2000g，5-6分鐘。b、充分裂解樣品。c、充分溶解內(nèi)標。d、加硅膠后，立即震蕩混合。e、清洗過程中要洗干凈裂解液或洗液，管壁上有殘留的裂解液或洗液1。g、洗脫后立即將核酸和硅膠分離。（核酸又被硅膠吸附）h、轉(zhuǎn)移核酸時避免吸入硅膠。i、充分溶解引物，立即振蕩溶解。j、充分溶解酶。放置時間要大于15分鐘。復(fù)溶時需在室溫下進行。k、用準確的微量加樣器加入足量引物。l、排除排管底部的氣泡，排管放到孵育器上時需壓緊。m、充分振蕩排管，完全混勻反應(yīng)體系液體。n、密封保存排管、離心管等耗材。o、控制環(huán)境中的抑制物污染。p、溫度需降至41℃時即將酶溶液混入反應(yīng)排管。錯誤代碼5：弱擴增曲線平緩，操作時溫度控制穩(wěn)定及混合充分錯誤代碼6：計算錯誤檢查電腦軟件錯誤代碼7：異常擴增正確加入核酸，保持電壓穩(wěn)定，嚴格控制引入抑制物。錯誤代碼8：延遲時間過短加入酶后及時進行擴增，操作熟練。錯誤代碼9：弱擴增常見錯誤，詳見代碼4。應(yīng)注意操作細節(jié)避免錯誤發(fā)生。錯誤代碼10：未檢測到內(nèi)標加入內(nèi)標，減少標本量或者稀釋樣本

再進行檢測。錯誤代碼11：信息不全操作時注意事項參考4和9中細節(jié)避免錯誤發(fā)生。錯誤代碼12：延遲時間過長導出結(jié)果，曲線截圖，公司工程師解決。二）bDNA問題處理方法注射器含有氣泡加適量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶內(nèi)液面下。分析儀底部的加熱托盤上有液體檢查管路連接。管路有堵塞或細菌滋生每次實驗后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空廢液瓶；每周清洗洗液瓶,水瓶和廢液瓶，管路系統(tǒng)。分析儀不能從孔內(nèi)吸取足夠的液體檢查廢液管連接頭RLU值低確定按產(chǎn)品要求儲存、配制試劑；環(huán)境溫度在18-30℃；試劑盒沒有過期；實驗中所使用的試劑來自同一批次；每周清洗過程中在管道和試劑瓶中沒有殘留。RLU值高確定全使用干凈的一次性無菌實驗材料；使用防氣溶膠的加樣槍頭；殘留的底物沒有倒回原瓶；用70%乙醇定期擦洗微量加樣器；盛洗液的試劑瓶內(nèi)有足夠量的洗液；檢查分液、吸液操作；每周進行保養(yǎng)；分析倉門關(guān)閉嚴實；檢查背景RLU值。變異系數(shù)(CV)高確定微量加樣器經(jīng)校準；使用防氣溶膠的槍頭；槍頭緊密套在加樣器上；加試劑時槍頭位置在孔的中部；樣品凝塊或殘渣沒有被吸??；樣品加的位置與樣品ID和DMS規(guī)定的位置一致；樣品按產(chǎn)品說明收集,處理和儲存；只使用干凈的一次性無菌實驗材料；檢查分液吸液操作；盛洗液的試劑瓶內(nèi)已裝有足夠量的洗液；每種試劑在實驗開始前被輕輕混勻；每種試劑預(yù)熱充分,以防有沉淀；封閉墊組裝正確；孔內(nèi)樣液沒有濺灑；分析倉門關(guān)閉嚴實；檢查RLU背景。標準曲線平坦或不正常加標準時板的缺口在左邊強或弱對照定量高確定各孔仔細加樣,未觸及鄰孔；使用無菌槍頭；封閉墊組裝無誤；加樣器定期校準；使用防氣溶膠的槍頭；標準和對照加樣位置正確；按產(chǎn)品說明要求儲存,配制。強或弱對照定量低確定試劑盒在運輸和到貨后儲存在正確的溫度；使用無菌槍頭；沒有吸取氣泡；封閉墊組裝無誤；加樣器經(jīng)校準；小心處理測試板,防止濺灑；標準和對

照加樣位置正確；按產(chǎn)品說明要求儲存,配制；樣品,標準,對照在吸取前至少震蕩5秒。打液不均勻排液殘余量過多WA檢查抽洗軸頭是否堵塞，如果有堵塞，卸下后用注射器疏通。背景光路值大于或等于0.05IRL檢查用于進行背景檢查的白色間隔反應(yīng)孔是否被污，檢查光路讀數(shù)頭是否有破損漏光現(xiàn)象實驗過程中一孔或者幾個孔出現(xiàn)WA2435或者WA2437報警，但儀器沒有停機，出現(xiàn)報警的孔沒有實驗結(jié)果。檢查實驗用水和次氯酸鈉是否達標，水是否有污染，管路是否有堵塞或者漏氣現(xiàn)象，反復(fù)清洗管路。檢查抽洗軸頭是否堵塞。儀器底部洗站周圍出現(xiàn)水跡或者有明顯漏水檢查蠕動泵管是否有破裂或者安裝錯誤，檢查洗站和排液管連接是否有裂縫。實驗過程中出現(xiàn)CL開頭的錯誤代碼檢查板架四角磁鐵是否有脫落現(xiàn)象，用AB膠粘好。實驗完成后打開艙門，發(fā)現(xiàn)試劑倉中部有明顯積水查看房間濕度是否低于60%，開除濕機除濕。打開儀器艙門，在儀器艙內(nèi)部放少量固體干燥劑三）Taqman問題處理方法設(shè)備出現(xiàn)未預(yù)料的資源錯誤重新啟動設(shè)備和AMPLILINK軟件AMPLILINK軟件出現(xiàn)數(shù)據(jù)庫錯誤重新啟動AMPLILINK軟件熱循環(huán)區(qū)域出現(xiàn)：TC溫度同步化；TC蓋同步化重新啟動設(shè)備條碼掃描機出現(xiàn)資源cmd為掃描機硬件錯誤，重新啟動設(shè)備條碼閱讀機出現(xiàn)條碼不可讀條碼松則采取條碼復(fù)位；條碼損壞則重新載入或生成新的序列/ID樣本量不準確樣本量不足0.970ml或超過1.030ml均不可檢測

附表2HIV-1病毒載量檢測樣品送檢/接收單送檢單位送樣人送檢日期采樣時間采樣管抗凝劑運輸保溫方式姓名性別年齡現(xiàn)住址戶籍所在地是否治療是治療號：否樣品編號樣品性質(zhì)樣品量（ml）備注接收單位接收人接收日期

附表3HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單實驗室名稱接收日期收到考核品量編號體積（ul）考核品狀態(tài)外包裝是否完整是否冰塊是否融化是否樣品是否融