免疫熒光技術(shù)的臨床應(yīng)用

關(guān)于免疫熒光技術(shù)的臨床應(yīng)用

隨著人們生活水平和意識(shí)的不斷提高，各種因素的影響，近年來每31個(gè)人中就有一個(gè)人在受到自身免疫性疾病的折磨，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，不易早期發(fā)現(xiàn)。第2頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

自身免疫性疾病涉及多學(xué)科（風(fēng)濕免疫科、內(nèi)分泌科、血液科、婦產(chǎn)科、皮膚科、腎病科、消化科等等）第3頁,共40頁，2024年2月25日，星期天自身免疫性疾病涉及多病種(混合結(jié)締組織病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、磷脂綜合癥、原發(fā)性系統(tǒng)性血管炎、韋格納肉芽腫、壞死性新月體腎小球腎炎、顯微多動(dòng)脈炎、習(xí)慣性流產(chǎn)、干燥綜合征、皮肌炎、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性膽管炎等等）第4頁,共40頁，2024年2月25日，星期天自身免疫性疾病的共同特征：患者血清中有多種自身抗體或自身反應(yīng)性致敏淋巴細(xì)胞存在，患者組織器官的病理特征為免疫炎癥，用相同抗原在某些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可復(fù)制出相似的疾病模型，多數(shù)病因不明，疾病有重疊現(xiàn)象，即一個(gè)病人可同時(shí)患一種以上自身免疫病，病程一般較長(zhǎng)，多遷延為慢性，有遺傳傾向。鑒于自身免疫性疾病的共同特征，通過檢測(cè)自身抗體可以有效準(zhǔn)確的診斷自身免疫性疾病，為臨床提供高效準(zhǔn)確的診斷依據(jù)。

第5頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

自身抗體檢測(cè)的開展，不僅讓我院在自身免疫性疾病診斷治療上有很大的提高，還可為隴東南地區(qū)400萬人口提供更準(zhǔn)確、更專業(yè)的自身免疫性疾病診斷服務(wù)。節(jié)省患者去外院檢測(cè)診斷所花費(fèi)的時(shí)間和費(fèi)用，使我院在整個(gè)地區(qū)具有一定的影響力，也會(huì)為醫(yī)院帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。鑒于此，我院完全有必要應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)開展自身抗體項(xiàng)目的檢測(cè)。第6頁,共40頁，2024年2月25日，星期天2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

1間接免疫熒光法（IFAIndirectFluorescentAssay

）3免疫印跡法（IB）WesternblotLIA4其它：IDA、RIA等第7頁,共40頁，2024年2月25日，星期天間接免疫熒光法實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞、組織切片或純化的、生化性質(zhì)明確的物質(zhì)均可作為檢測(cè)自身抗體或病原體抗體的抗原基質(zhì)。如標(biāo)本為陽性，已稀釋血清中的特異性抗體將與包被在固相上的抗原結(jié)合。第二步，已結(jié)合的抗體與熒光素標(biāo)記的抗人抗體結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。陽性標(biāo)本經(jīng)系列稀釋后可測(cè)出其滴度。最適稀釋因子為3.162（10的平方根），這樣，每隔一步就出現(xiàn)一個(gè)10的整數(shù)倍數(shù)（1:10、1:32、1:100、1:320、1:1000、1:3200,1:10000等第8頁,共40頁，2024年2月25日，星期天間接免疫熒光法檢測(cè)的特點(diǎn)特異性高：陽性與陰性標(biāo)本的熒光強(qiáng)度差別明顯。每種已結(jié)合的抗體在相應(yīng)抗原的位置產(chǎn)生典型的熒光模型?；|(zhì)中抗原譜完整，可檢測(cè)多種抗體，并且檢出率高。可在一種生物基質(zhì)上同時(shí)檢測(cè)多種抗不同生化特性抗原的抗體。當(dāng)酶免試劑所需要的抗原難以制備或無法獲得時(shí)，可選擇間接免疫熒光法。第9頁,共40頁，2024年2月25日，星期天自身抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)和最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法是間接免疫熒光檢測(cè)法（IFA)。需要熒光顯微鏡。操作者需要一定的專業(yè)知識(shí)。操作者需要一定的工作經(jīng)驗(yàn)。顯微鏡下的結(jié)果判斷為綜合知識(shí)的體現(xiàn)，到目前為止，尚沒有任何儀器可取代人工讀片。第10頁,共40頁，2024年2月25日，星期天國內(nèi)現(xiàn)狀自身抗體的測(cè)定不普遍欠規(guī)范對(duì)其意義了解尚少缺乏研究第11頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

自身抗體種類繁多常見自身抗體：抗核抗體譜(ANAS)檢測(cè)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）檢測(cè)類風(fēng)濕因子和抗CCP抗體自身免疫性肝病相關(guān)自身抗體檢測(cè)第12頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

檢驗(yàn)科

擬開展自身抗體檢測(cè)項(xiàng)目介紹及相關(guān)自身免疫性疾病第13頁,共40頁，2024年2月25日，星期天檢驗(yàn)項(xiàng)目試劑價(jià)格收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)抗核抗體（ANA）18.943.8ANA譜3180329.6雙鏈DNA2219.5角蛋白抗體（AKA）29.519.5環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體3978.2肝抗原譜9項(xiàng)176221.4蛋白酶3（PR3）、髓過氧化物酶（MPO）、腎小球腎炎78146.4抗中性粒細(xì)胞漿抗體3897.6過敏原特應(yīng)性組合300438第14頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗核抗體（ANA）定義——以細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)為抗原的抗體ANA可見于多種疾病，特別是結(jié)締組織疾病，常作為結(jié)締組織病的診斷、病情判斷和療效觀察的指標(biāo)（SLE的篩查抗體）。在非結(jié)締組織?。ǜ腥尽⒙?、肺纖維化或腫瘤）中也可出現(xiàn)陽性。正常人中（特別是老年人）也可出現(xiàn)陽性，但滴度低，并且常表現(xiàn)為IgM型。高滴度ANA則高度提示自身免疫性疾病。目前，ANA檢測(cè)已成為臨床上的一個(gè)極重要的自身免疫病的篩查實(shí)驗(yàn)。第15頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗核抗體（ANA）系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期95－100%非活動(dòng)期80－100%藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡100%混合性結(jié)締組織?。∕CTD、Sharp綜合征）100%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎20－40%進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥20－50%多發(fā)性肌炎及皮肌炎85－95%干燥綜合征30－50%慢性活動(dòng)性肝炎70－80%潰瘍性結(jié)腸炎30－40%其它風(fēng)濕病26%正常人5-10%第16頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗核抗體（ANA）方法——間接免疫熒光法結(jié)果判斷:①滴度〉1：100為陽性②常見核型——5種不同核型的臨床意義不同

第17頁,共40頁，2024年2月25日，星期天ANA常見五種核型及臨床意義核膜型——與抗ds-DNA有關(guān)，多見于SLE，特別是有腎炎者均質(zhì)型——與AHA、抗DNA有關(guān)，引起LE形成主要見于SLE、藥物性狼瘡斑點(diǎn)型——與抗ENA有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步查特異性抗體核仁型——多見于硬皮病著絲點(diǎn)型——多見于CREST綜合征第18頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

核膜型與抗ds-DNA有關(guān)，多見于SLE，特別是有腎炎者

均質(zhì)型與AHA（抗組蛋白抗體）、抗DNA有關(guān)，引起LE形成主要見于SLE、藥物性狼瘡第19頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

斑點(diǎn)型與抗ENA有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步查特異性抗體核仁型多見于硬皮病第20頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

著絲點(diǎn)型多見于CREST綜合征第21頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

抗核抗體譜（ANAs）項(xiàng)目包含nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白、AMAM2，共15項(xiàng)。抗nRNP抗體：高滴度的抗U1-nRNP抗體是混合性結(jié)締組織（MCTD，夏普綜合征）的標(biāo)志，陽性率為95-100%，抗體滴度與疾病活動(dòng)性相關(guān)，在30-40%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中也可檢出抗U1-nRNP抗體，但幾乎總伴有Sm抗體?？筍m抗體：抗Sm抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性抗體，與抗dsDNA抗體一起，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷指標(biāo)，但陽性率僅為5-10%?？筊o-52抗體：與其它抗體（如：SS-A）同時(shí)出現(xiàn)時(shí)則高度提示（SS-A）的相關(guān)疾病?？筍cl-70抗體：見于25-75%的進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（彌散型）患者中，因?qū)嶒?yàn)方法和疾病活動(dòng)性而異（Scl=硬化癥），在局限型硬化癥患者中未檢出該抗體。

第22頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗核抗體譜（ANAs）抗SS-A抗體：與各類自身免疫性疾病相關(guān)，最常見于干燥綜合征（40-80%）、也見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（30-40%）和原發(fā)性膽汁性肝硬化（20%）中，偶見于慢性活動(dòng)性肝炎。此處，在100%的新生兒紅斑狼瘡中抗SS-A抗體陽性。該抗體可經(jīng)胎盤傳給胎兒引起炎癥反應(yīng)和新生兒先天性心臟傳導(dǎo)阻滯?？筍S-B抗體：幾乎僅見于干燥綜合征（40-80%）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（10-20%）的女性患者中，男女比例為1：29。在干燥綜合征中SS-A抗體和抗SS-B抗體常同時(shí)出現(xiàn)?？笿o-1抗體：見于多肌炎、陽性率為25-30%。常與合并肺間質(zhì)纖維化相關(guān)?？怪z點(diǎn)抗體（CENPB）：與局限型進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（CREST綜合征：鈣質(zhì)沉著、Raynaud病、食管功能障礙、指硬皮病、遠(yuǎn)端血管擴(kuò)張）有關(guān)，陽性率為70-90%。在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者中也可檢測(cè)到該抗體（陽性率為10-30%。還可出現(xiàn)于雷諾氏綜合征中。第23頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗核抗體譜（ANAs）抗dsDNA抗體：對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有很高的特異性。除抗Sm抗體外，抗dsDNA抗體也可做為該病的一個(gè)血清學(xué)標(biāo)志，陽性率40-90%，且與疾病的活動(dòng)度相關(guān)，可用于療效監(jiān)測(cè)?？购诵◇w抗體：系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中的陽性率為50-95%，特異性幾乎為100%。核小體是細(xì)胞染鈀體的功能亞單位，由DNA和組蛋白以特殊的且成。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期抗核小體抗體比抗dsDNA抗體、抗組蛋白抗體更早出現(xiàn)，對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的誘因和致病有重要作用。組蛋白抗體：一種或幾種組蛋白抗體或抗H2A-H2B復(fù)合物抗體在藥物（普魯卡因胺、肼酞嗪以及其它藥物）誘導(dǎo)的藥斑狼瘡中比較常見（陽性率95%）。另外，在30-70%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡和15-50%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中也可檢出抗組蛋白抗體。抗核糖體P蛋白抗體：是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性標(biāo)志，陽性率為5-15%。普遍認(rèn)為ARPA的滴度與SLE的活動(dòng)性相關(guān)，還與SLE的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、腎臟或肝臟受累相關(guān)。第24頁,共40頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗ds-DNA抗體臨床意義①對(duì)SLE的診斷有較高特異性②滴度與SLE活動(dòng)相關(guān)，可作為病情監(jiān)測(cè)及療效觀察指標(biāo)③與SLE腎損害有關(guān)檢測(cè)方法①放免法（Farr)——敏感，有利于早期預(yù)測(cè)檢測(cè)高親合力的抗ds-DNA②間接免疫熒光法(IF)——特異③ELISA——可檢測(cè)低親合力的抗ds-DNA

有助于中樞狼瘡的病情監(jiān)測(cè)④金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法第26頁,共40頁，2024年2月25日，星期天抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP）瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微絲蛋白相關(guān)抗體的主要抗原決定簇對(duì)RA診斷具有高度特異性（98%）可在RA早期出現(xiàn)預(yù)測(cè)早期關(guān)節(jié)炎發(fā)展為RARA關(guān)節(jié)侵蝕破壞的早期識(shí)別及預(yù)測(cè)第27頁,共40頁，2024年2月25日，星期天我科開展的自身免疫肝炎系列抗體包括：抗肝細(xì)胞膜抗體(抗LMA)抗肝腎微粒體抗體（抗LKM抗體）抗肝-胰抗體(抗LP抗體)抗可溶性肝細(xì)胞抗體（抗SLA）抗線粒體抗體（AMA）第28頁,共40頁，2024年2月25日，星期天肝抗原譜9項(xiàng)SLA/LP：抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體；是AIH的最特異診斷指標(biāo)，陽性率10-30%，特異性100%。RO-52：不具有疾病特異性AIH其他診斷指標(biāo)：1）ANA30-40%；2）ASMA抗平滑肌抗體（F-肌動(dòng)蛋白）40-90%3）肝細(xì)胞膜抗原抗體35%4）去唾液酸糖蛋白受體80-90%PBC其他診斷指標(biāo)：1）AMA-M455%2）AMA-M855%3）AMA—M935-85%4）核點(diǎn)30%PSC（原發(fā)性硬化性膽管炎）：在PSC中最常見的自身抗體為PANCA（陽性率為70-80%）重疊綜合征（主要發(fā)生于自免性肝病之間）第29頁,共40頁，2024年2月25日，星期天(一)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）

類風(fēng)濕因子（RF）早期診斷的系列指標(biāo)抗RA33/36抗體 抗核周因子（APF）抗角蛋白抗體（AKA）抗Sa抗體抗環(huán)瓜氨酸抗體（抗CCP）

第30頁,共40頁，2024年2月25日，星期天(二)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種臨床表現(xiàn)有多系統(tǒng)損害癥狀的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其血清有以抗核抗體為主的大量不同的自身抗體自身抗體（1）抗核抗體譜——ANA、抗ds-DNA、抗ENA抗體（2）抗磷脂抗體（3）抗組織細(xì)胞抗體——抗RBC抗體抗血小板相關(guān)抗體抗神經(jīng)元抗體（4）其它——RF、p-ANCA第31頁,共40頁，2024年2月25日，星期天(三)皮肌炎/多發(fā)性肌炎（PM/DM）免疫學(xué)檢查ANAENA——抗Jo-1陽性其它檢查——肌酶譜肌酸磷酸激酶（CPK）:MM-心肌和骨骼肌

MB-心肌

BB-平滑肌和腦內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）堿性磷酸酶（ALP）第32頁,共40頁，2024年2月25日，星期天(四)干燥綜合征（SS）ANA——陽性率40%~70%ENA——抗SSA抗體陽性率70%~96%

抗SSB抗體陽性率50%~87%抗α-Fordrin——對(duì)于pSS或sSS的診斷有一定意義，但特異性和敏感性并不理想。RF——陽性率75%~100%高球蛋白血癥WBC下降第33頁,共40頁，2024年2月25日，星期天(五)系統(tǒng)性硬化?。╬SS）ANA——陽性率50%~55%ENA——抗Scl-70陽性率15%~40%抗著絲點(diǎn)抗體(ACA)陽性第34頁,共40頁，2024年2月25日，星期天(六)混合性結(jié)締組織?。∕CTD）ANA陽性ENA——抗RNP高滴度陽性第35頁,共40頁，2024年2月25日，星