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文檔簡介
ICS07.080
B20/39
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
GB/TXXXXX—201X
蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測方法
DetectionmethodofactivityandimpurityofproteinaseK
(征求意見稿)
201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施
中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局
中國國家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會
發(fā)布
GB/T××××—201×
GB/T××××—201×
蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測方法
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蛋白酶K檢測原理、儀器設(shè)備及器具、主要試劑、分析步驟和結(jié)果分析。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于生化試劑蛋白酶K產(chǎn)品的生產(chǎn)、監(jiān)督和檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
GB/Txxxx核糖核酸酶活力檢測
GB/Txxxx脫氧核糖核酸酶活力檢測
3術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
3.1
蛋白酶K(proteinaseK)
能水解天然角蛋白(keratin)的一種絲氨酸蛋白酶。
3.2
蛋白酶K酶活力單位(proteinaseKactivityunit)
在57℃和pH8.0條件下,在1min內(nèi)水解血紅蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表
示)的酶量,為一個酶活力單位,以U表示。
4原理
蛋白酶K具有很高的水解活性,可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵斷裂。它在57℃和
pH8.0條件下,水解血紅蛋白底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸;在堿性條件下,可將福林(Folin)試劑還原,
生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán),其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在680nm測定其吸光度,得到酶解產(chǎn)生的
酚基氨基酸的量,進(jìn)而計算蛋白酶活力。
5儀器設(shè)備及器具
5.1恒溫水浴鍋:精度為±0.2℃。
5.2pH計:精度為0.1pH單位。
5.3分光光度計:波長范圍380~780nm,吸光度值精確至0.001。
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GB/T××××—201×
5.4比色皿:1cm。
5.5電子天平:精度為0.0001g和0.01g。
5.6高速離心機(jī):最小離心力為8000×g,具1.5mL離心管。
6主要試劑
本方法所用試劑均為分析純,除特殊說明外,實驗用水均為GB/T6882規(guī)定的二級水。
6.10.01mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液(Tris-HCl),pH8.0
稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.11g,加入適量水使其溶解,定容至100mL,用濃鹽酸調(diào)至pH8.0,
即成1mol/LTris-HCl緩沖液。再取1mL1mol/LTris-HCl緩沖液,加水定容至100mL,即成0.01mol/L
Tris-HCl緩沖液。
6.20.4mol/L三氯乙酸溶液
稱取三氯乙酸65.40g,用水溶解并定容至1000mL。
6.31mol/LHCl溶液
取8.50mL濃鹽酸加入到50mL水中稀釋,然后定容至100mL,得1mol/LHCl溶液。
6.40.1mol/LHCl溶液
取10.00mL1mol/LHCl溶液加水定容至100mL,得0.1mol/LHCl溶液。
6.51%(w/v)血紅蛋白溶液
準(zhǔn)確稱取血紅蛋白1.000g,用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解,并定容至100mL。此溶液在
4℃冰箱貯存,有效期為3天。
6.60.4mol/L碳酸鈉溶液
稱取無水碳酸鈉42.40g,用水溶解并定容至1000mL。
6.7福林(Folin)試劑
于2000mL磨口回流裝置加入鎢酸鈉(Na2WO4.2H2O)100.0g、鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)25.0g、水
700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h。取下回流冷卻器,在通風(fēng)櫥中加入硫酸鋰
(Li2SO4)50g、水50mL和數(shù)滴濃溴水。再微沸15min,以除去多余的溴,至冷卻后無綠色。加水定容
至1000mL?;靹颍^濾。試劑應(yīng)呈金黃色。貯存于棕色瓶內(nèi),避光保存。使用時,用1份福林試劑與2
份水混勻,制成稀福林試劑。也可將商品化福林試劑按照產(chǎn)品使用指南稀釋成稀福林試劑。
6.8100μg/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液
稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用20mL1mol/LHCl溶液溶解后,再用水定容至
100mL,即為1mg/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,在4℃冰箱貯存。臨用前,吸取1mg/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲
備溶液10.00mL,用0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。
7分析步驟
2
GB/T××××—201×
7.1核糖核酸酶(RNase)
按GB/Txxxx-201x進(jìn)行檢測。
7.2脫氧核糖核酸酶(DNase)
按GB/Txxxx-201x進(jìn)行檢測。
7.3酶活力
7.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
按表1,在10mL容量瓶中配制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
表1L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制
管號酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100μg/mL酪氨酸標(biāo)水(mL)
的濃度(μg/mL)準(zhǔn)溶液(mL)
00.00.0010.00
110.01.009.00
220.02.008.00
330.03.007.00
440.04.006.00
550.05.005.00
660.06.004.00
分別吸取L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1.0mL于具塞試管中(每個濃度作2個平行),然后加入5.0mL碳
酸鈉溶液和1.0mL稀福林試劑,混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時置于40℃水浴,反應(yīng)20min,取出,用冷水迅速冷
卻至室溫,用分光光度計,在680nm波長下,以不含酪氨酸的0號管為空白,用1cm比色皿,測定吸光
度(A)。
以吸光度A為縱坐標(biāo),以L-酪氨酸的濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(此線應(yīng)通過零點)。得出線
性回歸方程和回歸系數(shù)(R2)。回歸系數(shù)在0.9990及以上時,方可使用,否則應(yīng)重做。
新配制的福林試劑應(yīng)制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.3.2固體待測樣品制備
稱取0.0050g固體酶,精確至0.0001g,用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解,并稀釋至酶濃
度曲線中呈線性關(guān)系的酶濃度范圍內(nèi)。
7.3.3液體待測樣品制備
吸取100μL液體酶,用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液稀釋至酶濃度曲線中呈線性關(guān)系的酶濃度
范圍內(nèi)。
7.3.4測定
取3支10mL具塞試管,樣品空白管1支,樣品管2支。分別向3支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測酶
液1.0mL,在57℃下水浴預(yù)熱5min。向2支樣品管中加入1.0mL經(jīng)同樣預(yù)熱的1%血紅蛋白溶液,準(zhǔn)確
計時反應(yīng)10min;迅速、準(zhǔn)確地向3支試管中加入2.0mL0.4mol/L三氯乙酸溶液;于樣品空白管中加入
1.0mL1%血紅蛋白溶液,混勻。3支試管繼續(xù)在57℃下水浴10min,取出,迅速冷卻至室溫,11000×g
3
GB/T××××—201×
離心5min。
另取3支10ml具塞試管,樣品空白管1支,樣品管2支,分別吸取上述相應(yīng)上清液1.0mL于3支試
管,然后均加入5.0mL碳酸鈉溶液、1.0mL稀福林試劑,混勻,40℃水浴20min顯色。迅速冷卻至室溫。
與此同時,另取1支試管,用水代替上清液做試劑空白,均加入5.0mL碳酸鈉溶液、1.0mL稀福林試劑,
混勻,40℃水浴20min顯色,迅速冷卻至室溫。
以試劑空白管調(diào)儀器零點,用分光光度計于波長680nm下,用1cm比色皿,分別測定樣品空白管(A0)
和樣品管中樣液的吸光度(A)。將樣品管與樣品空白管吸光度之差取平均值,經(jīng)線性回歸方程求解生成
的酪氨酸濃度(C-C0)。
8結(jié)果分析
8.1酶活力計算
按照式(1)計算:
C-C4N
0....................
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