具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法

具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法專利名稱：：具有肌醇六磷酸酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法技術領域：：本發(fā)明涉及具有^L醇六磷酸酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關領域的描述WO2006/043178公開了一種來自布丘氏菌屬Pl-29(ButtiauxellaP1-29)(作為NCIMB41248保藏)的具有WO2006/043178中SEQIDNO:3的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，以及它的某些變體。布丘氏菌屬野生型肌醇六磷酸酶的序列及其多種變體已經(jīng)提交至GENESEQP數(shù)據(jù)庫，具有以下登錄號AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。這些肌醇六磷酸酶均與SEQIDN0s:2、4和6中的任何一個具有70。/。以上(above70%)的同一性百分比，然而它們不包含119N、120L和/或121E中的至少一種，如上文所限定。來自變形肥桿菌(Obesumbacteriumproteus)的肌醇六磷酸酶的序列已經(jīng)提交至UNIPROT數(shù)據(jù)庫，登錄號為Q6U677。這種也由Zinin等在FEMSMicrobiologyLetters,236巻，283-290頁，2004中進行了描述的肌醇六磷酸酶，與SEQIDNOs:2、4和6具有70%以上的同一性百分比，然而這種肌醇六磷酸酶也不包含119N、120L和/或121E中的至少一種，如上文所限定。本發(fā)明的目的是提供具有肌醇六磷酸酶的改進的多肽，和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有改進的比活性(specificactivity),改進的穩(wěn)定性，如改進的溫度和/或pH穩(wěn)定性，改進的pH活性譜(profile)，改進的溫度活性譜，改進的底物譜，改進的在體外在動物飼料中的性能，和/或改進的在體內(nèi)在動物飼料中的性能。發(fā)明內(nèi)容在第一方面，本發(fā)明涉及具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)當使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩陣，10.0的缺口產(chǎn)生罰分(gapopeningpenalty)和0.5的缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413比對時，與上述各氨基酸序列具有至少70%同一性；并且b)當如a)中所述與SEQIDNO:2的氨基酸1-413比對并且使用與SEQIDNO:2的氨基酸1-413對應的氨基酸殘基編號時，在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一種119N、120L和/或121E。在一個具體的實施方案中，所述多肽在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一種109Q、111G、119N、120L和/或121E。在另一具體的實施方案中，所述多肽a)與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少78%同一性，例如，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97°/。同一性，至少980/o同一性，至少99%同一性；并且b)在所示的位置包含以下氨基酸中的至少一種109Q、111G、119N、120L、121E和/或193Q。在另一方面，本發(fā)明涉及具有肌醇六磷酸酶活性并且具有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列a)與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少78%同一性，如，%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，至少99%同一性；并且b)在指定的位置包含以下氨基酸中的至少一種1S、101、38S、66E、71K、81A、109Q、111G、119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A，T、268A,T、277T、283D，E、285K、287D、288A，V、293G、296S、303L、314A、3371、345A、3501、364A、371K、372E、396P、399K、406E和/或413P。在另一方面，本發(fā)明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其選自下組(i)包含SEQIDNO:2的成熟部分(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-413的序列)的多肽；(ii)(i)的變體，其包含以下取代中的至少一種K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E,T、A209S、D211C、A235V、E248L、Q256H，Y、A261E、N270K、D283N、A288E、I303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的變體，其包含以下取代中的至少一種N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、T81A、R141Q、L142V、T152M、E155D、V214I、K239N、D245E、E248S、A255T、R268A,T、A277T、D283E、N285K、T287D、A288V、D293G、P296S、1303L、S314A、1337V、A345S、V350I、A364S、K371N、E372Q、P396S、K399T、E406V和/或Q413P。在另一方面，本發(fā)明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其選自下組(i)包含SEQIDNO:4的成熟部分(例如SEQIDNO:4的氨基酸1-413的序列)的多肽；(ii)(i)的變體，其包含以下取代中的至少一種K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E,T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H，Y、A261E、N270K、E283N、V288E、I303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的變體，其包含以下耳又代中的至少一種S1N、19V、S38T、Q66E、K71Q、T81A、Q141R、V142L、M152T、E155D、1214V、N239K、E245D、S248E、T255A、A268R,T、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、D293G、S296P、簡L、A314S、V337LS345A、1350V、A364S、N371K、E372Q、S396P、T399K、V楊E和/或P413Q。本發(fā)明的另一方面涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其選自下組(i)包含SEQIDNO:6的成熟部分(例如SEQIDNO:6的氨基酸1-413的序列)的多肽；(ii)(i)的變體，其包含以下取代中的至少一種K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、Sl薩、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、L303F和/或N318D;和(iii)(i)或(ii)的變體，其包含以下取代中的至少一種N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、A81T、Q141R、V142L、T152M、D155E、1214V、N239K、E245D、S248E、A255T、T268A，R、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、G293D、P296S、L303I、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。本發(fā)明的另一方面涉及具有如下氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的氨基酸1-413、SEQIDN0:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少80%同一性，例如，至少85%同一性，至少卯％同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，至少99%同一性。在另一方面，本發(fā)明涉及具有如下氨基酸序列的肌醇六磷酸酶變體，所述氨基酸序列與包含以下GENESEQP序列中任意一個的成熟部分(例如氨基酸34-446的序列)的多肽具有至少70%同一性，至少75%同一性，至少80%同一性，如，至少85%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，至少99%同一性AEH25057、AEH25059、AEH25058、AEH25067、AEH25071、AEH25072、AEH25074、AEH25076、AEH25073、AEH25070、AEH25069、AEH25066、AEH25060、AEH25068、AEH25063、AEH25065、AEH25062、AEH25061、AEH25056、AEH25051或AEH25064;所述變體具有肌醇六磷酸酶活性，并且包含以下取代中的至少一個N1S、VIOI、T38S、Q66E、Q71K、T81A、E109Q、H111G、D119N、1120L、K121E、Q141R、V142L、T152M、D155E、L193Q、1214V、N239K、E245D、S248E、V255A,T、R268A,T、A277T、N283D,E、N285K、T287D、E288A,V、D293G、P296S、簡L、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及多肽的變體，其包含GENESEQP:AEH25075的成熟部分(例如氨基酸34-446的序列)，所述變體具有肌醇六磷酸酶活性，并且包含以下取代中的至少一種N1S、VIOI、T38S、Q66E、Q71K、T81A、E109Q、H111G、D119N、1120L、K121E、Q141R、V142L、T152M、D155E、L193Q、1214V、N239K、E245D、S248E、V255A，T、R268A，T、A277T、N283D,E、N285K、T287D、E288A，V、D293G、P296S、F303L、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。在這些方面的每一個中，對于計算同一性和確定氨基酸殘基位置，都如上文第一方面中所述生成比對。本發(fā)明還涉及編碼這些多肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體和重組宿主細胞，還涉及用于產(chǎn)生和使用這些多肽的方法。本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的動物伺料組合物。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的肌醇六磷酸酶改進動物飼料的營養(yǎng)價值的方法。本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明的肌醇六磷酸酶處理蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)包括植物蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述發(fā)酵產(chǎn)物諸如，例如，乙醇、啤酒、葡萄酒(wine)，其中所述發(fā)酵在本發(fā)明的MJ享六磷酸酶存在下進行。附圖筒述圖1顯示對本發(fā)明的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6預期的成熟部分連同具有以下GENESEQP登錄號的序列的多重比對AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。比只十是4吏用Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS5:151-153),使用LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI),用同一性表和以下多重比對參數(shù)進行的缺口罰分為10,并且缺口長度罰分(gaplengthpenalty)為10。配對比對參數(shù)是K元組(Ktuple)=1,缺口罰分=3,窗口(windows)=5,和對角線(diagonals)二5。圖2顯示UNIPROT登錄號Q6U677與SEQIDNO:2的氨基酸1-413的比對。比對是使用Needle程序，使用矩陣BLOSUM62、IO.O的缺口產(chǎn)生罰13分和0.5的缺口延伸罰分進行的。發(fā)明詳述結構因素(StructuralConsiderations)使用大腸桿菌(E.coli)AppA肌醇六磷酸酶的結構作為模板，通過同源性建才莫建立了本發(fā)明的三個肌醇六磷酸酶(SEQIDNOs:2、4和6的成熟部分)的結構(ProteinDataBankid:1DKN;Lim等，Nat.Struct.Biol.(2000)，2巻，108-113頁)。位置119-121面對活性部位裂縫(activesitecleft),因此預期在這些位置的特定氨基酸對比活性有影響。對于增加比活性，據(jù)估計119N是較好的選擇，其次是121E，最后是120L。位置109和111靠近受到少量應力(abitstressed)的區(qū)域中的二硫鍵(disulfide),因此預期在這些位置的特定氨基S吏對穩(wěn)定性(特別是對熱穩(wěn)定性)有影響。lllG可能優(yōu)于109Q。位置193是另一個可能影響酶穩(wěn)定性的區(qū)域。193Q可以提供良好的穩(wěn)定性。相應的肌醇六磷酸酶變體，和其它肌醇六磷酸酶變體(例如，包含一個或多個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的變體)，可以通過本領域已知的方法制備，并且如實驗部分中所述進^"測試。肌醇六磷酸酶多肽，同一性的百分比在本文中，肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，即催化肌醇六磷酸鹽(phytate)水解成(l)肌醇和/或(2)它的單、二、三、四和/或五磷酸鹽和(3)無機磷酸鹽的酶。在本文中，術語肌醇六磷酸酶底物包括，但不限于，肌醇六;奔酸和任何肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸的鹽)，以及上文(2)中所列的磷酸鹽。因特網(wǎng)上的ENZYME站點(www.expasy.ch/enzyme/)是與酶的命名法相關的信息的儲藏庫。其主要基于國際生物化學與分子生物學聯(lián)合會命名委員會(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)(IUB-MB)的建議，并描述了各種類型的表征的酶，并為這些酶提供了EC(EnzymeCommission(酶學委員會))號(BairochA.TheENZYMEdatabase,2000,NucleicAcidsRes28:304-305)。同樣參見NC-IUBMB,1992的酶命名手冊(handbookEnzymeNomenclature)。根據(jù)ENZYME網(wǎng)站，已知三種不同類型的肌醇六磷酸酶所謂的3-肌醇六磷酸酶(或稱l-肌醇六磷酸酶；力幾醇六磷酸酯3-磷酸水解酶(myo-inositolhexaphosphate3-phosphohydrolase))，所謂的4_肌醇六磷酸酶(或稱6-月幾醇六磷酸酶，基于1L編號系統(tǒng)而非1D編號命名，EC3丄3.26)，和所謂的5-肌醇六磷酸酶(EC3丄3.72)。就本發(fā)明而言，全部三種類型均包括在肌醇六磷酸酶的定義中。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶屬于酸性組氨酸磷酸酶家族，該家族包括大腸桿菌(Escherichiacoli)pH2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌肌醇六磷酸酶例如泡盛曲霉(Aspergillusawamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC:)(基因phyA和phyB)。多種組氨酸酸性磷酸酶共享兩個具有序列相似性的區(qū)域，每個均以保守的組氨酸殘基為中心圍繞在其周圍。這兩個組氨酸似乎涉及酶的催化機制。第一組氨酸位于N-末端部分，并且形成磷-組氨酸中間物，而第二個位于C末端部分，并且可能充當質(zhì)子供體。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性部位基序，即R-H-G-V-R-A-P(參見SEQIDNOs:2、4和6的氨基酸18-24)。就本發(fā)明而言，肌醇六磷酸酶活性是以FYT單位測定的，一個FYT是在以下條件下每分鐘釋放1微摩爾無機正磷酸根的酶量pH5.5;溫度37。C;底物濃度為10.8mmol/l的肌醇六磷酸鈉(C6H6024P6Na,2)。肌醇六磷酸酶活性優(yōu)選使用本文實施例3中的測定法來測定。其它合適的肌醇六磷酸酶測定法是WO00/20569的實施例1中描述的FYT和FTU測定法。FTU用于測定飼料和預混物(pi'emix)中的肌醇六磷酸酶活性。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶是分離的。術語"分離的"如用于本文是指這樣的多肽，如通過SDS測定，所述多肽是至少20%純的，優(yōu)選至少40%純的，更優(yōu)選至少60%純的，甚至更優(yōu)選至少80%純的，最優(yōu)選至少90%純的，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的，例如，至少96%、97%、98%、99%和更高的純度。具體而言，優(yōu)選多肽是"基本上純的形式(essentiallypureform)",即，所述多肽制備物基本上不含(essentiallyfreeof)其它與該多肽制備物天然結合的(nativelyassociated)多肽物質(zhì)。例如，這可以通過以公知的重組方法和/或通過經(jīng)典純化方法制備多肽來實現(xiàn)。當在本文使用時，術語"成熟部分"是指由細胞分泌的多肽的部分，所述細胞含有編碼該多肽的多核苷酸作為其遺傳部件(geneticequipment)的部分。通常，成熟多肽部分是指一旦N末端信號肽部分完成了其指導編碼多肽進入細胞分泌途徑的功能而被切除之后剩余的多肽部分。然而，經(jīng)驗顯示在分泌過程中有時也發(fā)生少量的C末端截短。術語成熟部分如用于本文也將這樣的C末端截短考慮在內(nèi)(如果它存在的話)。SEQIDNOs:2、4和6的預期信號肽部分是SEQIDNO:2的氨基酸-33至-1、SEQIDNO:4的氨基酸-9至-1(這是部分信號肽)和SEQIDNO:6的氨基酸-33至-1(參見本申請包括的序列表)。由SEQIDNO:7編碼的SEQIDNO:8也是信號肽。由于我們目前不清楚任何在分泌過程中發(fā)生的C末端截短，所以預期的SEQIDNO，:2、4和6的成熟部分是它們的氨基酸1-413。在本發(fā)明的不同方面中，兩個氨基酸序列之間的相關性用參數(shù)"同一性"來描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列的比對是通過使用來自EMBOSS軟件包(http:〃)的Needle程序確定的，優(yōu)選版本2.8.0。Needle程序執(zhí)行在Needl謹n,S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的全局比對算法(globalalignmentalgorithm)。所用的取代矩陣是BLOSUM62,缺口產(chǎn)生罰分(gapopeningpenalty)是10.0,并且缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列("發(fā)明序列")和權利要求中涉及的氨基S臾序列(例如SEQIDNO:2的氨基酸l-413)之間的同一性程度，是通過兩個序列比對中精確匹配的數(shù)目，除以"發(fā)明序列"的長度或SEQIDNO:2的氨基酸1-413的長度中最短的一個來計算。結果以百分比同一性表示。當"發(fā)明序列"和SEQIDNO:2在重疊的相同位置具有相同的氨基酸殘基時發(fā)生精確匹配(在下文的比對實例中用T代表這種情況)。序列的長度是序列中的氨基酸殘基數(shù)(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-413的長度是413)。在以下的純假設性比對實例中，重疊是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL"或序列2的氨基酸序歹寸"HGWGEDANL"。在該實例中，缺口用"-"表示。假設性比對實例序列1:ACMSHTWGER-NLImil序列2:HGWGEDANLAMNPS16在一個具體的實施方案中，多肽的氨基酸序列與或相對于例如SEQIDNO:2的氨基酸1-413的同一性百分比是通過如下來確定的i)使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩陣、10.0的缺口產(chǎn)生罰分和0.5的缺口延伸罰分來比對所述兩個氨基酸序列；ii)計數(shù)比對中精確匹配數(shù)；iii)用精確匹配數(shù)除以兩個氨基酸序列中最短的序列的長度，iv)將iii)除得的結果轉(zhuǎn)換成百分比。在上文的假設性實例中，精確匹配數(shù)是6，兩個氨基S拼列中最短的序列的長度是12;因此同一性百分比是50%。另一比對實例示于圖2，其中將來自變性月巴桿菌(Obesumbacteriumproteus)的肌醇六磷酸酶(UNIPROT:Q6U677)與SEQIDNO:2的氨基酸1.413比對。由這個比對顯示，UNIPROT:Q6U677與SEQIDNO:2的氨基酸1-413的同一性百分比是76.3%(315個精確匹配，最短序列的長度是413)。在本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的具體實施方案中(即根據(jù)本發(fā)明的不同方面中的任何一個)，與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個的同一性程度是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在更進一步的具體實施方案中，同一性程度是至少90.0%、90.2%、90.4%、90.6%、90.8%、91.0%、91.2%、91.4%、91.6%、91.8%、92.0%、92.2%、92.4%、92.6%、92.8%、93.0%、93.2%、93.4%、93.6%、93.8%、94.0%、94.2%、94.4%、94.6%、94.8%、95.0%、95.2%、95.4%、95.6%、95.8%、96.0%、96.2%、96.4%、96.6%、96.8%、97.0%、97.2%、97.4%、97.6%、97.80/o、98.0o/o、98.20/0、98.40/0、98.60/0、98.80/0、99.00/0、99.20/o、99.40/0、99.60/0或至少99.8%。在更進一步的具體實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有(或具有氨基酸序列，其差異為)如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQlDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9處或不多于10處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于ll、12、13、14、15、16、17、18、19處或不多于20處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于21、22、23、24、25、26、27、28、29處或不多于30處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于31、32、33、34、35、36、37、38、39處或不多于40處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于41、42、43、44、45、46、47、48、49處或不多于50處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于51、52、53、54、55、56、57、58、59處或不多于60處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸卜413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于61、62、63、64、65、66、67、68、69處或不多于70處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基S吏1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于71、72、73、74、75、76、77、78、79處或不多于80處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于81、82、83、84、85、86、87、88、89處或不多于90處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于91、92、93、94、95、96、97、98、99處或不多于100處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于IOI、102、103、104、105、106、107、108、109處或不多于110處的變化；如與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于111、112、113、114、115、116、117、118、119處或不多于120處的變化;或與SEQIDNO:2的氨基酸1_413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個相比不多于121、122、123或124處的變化。在本發(fā)明肌醇六磷酸酶的可供選擇的實施方案中，相對于SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413中任意一個的同一性程度是至少55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。位置編號本文使用的(即根據(jù)本發(fā)明不同方面中任何一個方面的)用于限定氨基酸位置的命名法基于源自伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxdlagaviniae)DSM18930的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，即其預期的成熟序列，其為SEQIDNO:2的氨基酸1-413。因此，在本上下文中，用于位置編號的基礎是SEQIDNO:2，始于N1并且止于Q413。這種位置編號在圖1的比對中顯示為第一行，并且在圖2的比對中也顯示了這種編號方式(比對的上排)。變化，如取代、缺失、插入本發(fā)明(即，根據(jù)本發(fā)明的不同方面中的任何一個方面)的肌醇六磷酸酶，其是野生型或變體，可以相對于模板(即參照或比較性氨基酸序列例如SEQIDNO:2的氨基酸l-413)包含多種類型的變化可以將一個氨基酸用另一個氨基酸取代；可以缺失氨基酸；可以插入氨基酸；以及任何數(shù)目的這些變化的任意組合。在本上下文中，術語"插入"意欲還包括N末端和/或C末端延伸，并且術語"缺失"意欲還包括N末端和/或C末端截短。本文用于單變化的通用命名法如下XDcY，其中"X"和"Y"獨立地表示單字母氨基酸代碼，或"*","D"表示一個數(shù)字，且"c"表示按字母順序計數(shù)(a、b、c等等)，其僅在插入中出現(xiàn)。參考下文表l,其中描述了將這種命名法應用于多種類型的變化的純假設性實例。tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20如上文所解釋的，位置號("D")從SEQIDNO:2的氨基酸1-413的第一氨基酸殘基起計算。在相同序列中的幾個變化用7"(斜線)分隔，例如標識"l*/2*/3*，，表示在位置號l、2f^3的氨基酸全部缺失，標識"104A/105F"表示位置號104的氨基S交被A取代，并且位置號105的氨基酸被F取代?？蛇x擇的變化用(逗號)分隔，例如，標識"255A,T"表示位置255上的氨基酸被AiT取代。本文在各種其他不勝枚舉的可能性中所用的逗號表示它們通常在語法上的作用，即通常是和/或。例如，列舉"255A,T，楊E，和/或413P，，中第一個逗號表示二中選一(AiT),而后面的兩個逗號應理解為和/或的選擇:255A或255T，和/或406E,和/或413P。在本文中，"至少一個"(例如在指定位置的氨基酸，或取代)表示一個或多個，例如1,2，3,4,5,6,7，8,9或10個氨基酸(或取代)；或12,14，15，16,18，20,22，24,25，28或30個氨基酸(或取代)；等等，直至最多的變化數(shù)目為125，130,140，150，160,170，180，190或200個。對用什么取代或延伸沒有進行任何指定的取代或延伸是指除了在模板中占據(jù)該位置的氨基酸以外，插入任何天然的，或非天然的氨基酸。鑒定相應的位置號如上文所解釋，本文使用伽瓦尼布丘氏菌DSM18930的成熟肌醇六磷酸酶(SEQIDNO:2)作為位置編號的標準，因此也是命名法的標準。對于另外的肌醇六磷酸酶，其是野生型或變體，對應于SEQIDNO:2中位置D的位置通過如標題為"肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比，，一節(jié)中所詳細說明的比對兩個序列來查找到。從比對中，本發(fā)明序列中與SEQIDN0:2的位置D相對應的位置可以清晰地和明白地鑒定出來(在比對中互在對方頂部的那兩個4立置(thetwopositionsontopofeachotherinthealignment))。現(xiàn)有一些從上文表1得到的純假設性實例，其在第三欄中包括多個對兩個序列的比對參照表l第一行第三格上排序列是模板，下排是變體。位置號80是指模板中的氨基酸殘基G。氨基酸A占據(jù)變體中相應的位置。因此，將這種取代命名為G80A。再參照表1第二行第三格上排序列還是模板且下排是變體。位置號80還是指模板中的氨基酸殘基G。變體具有兩個插入，即TY，在模板的G80之后V81之前。盡管T和Y在變體氨基酸序列中當然也將具有它們自己"真正的"位置號，但是就此處而言，我們總是指模板位置號，而因此T和Y分別稱作位置號80a和80b。最后，參照表l最后一行的第三格位置號275是指模板中最后的氨基酸。將C末端延伸ST分別稱作位置號275a和275b,盡管它們在變體氨基酸序列中當然也擁有它們自己"真實的"位置號。這樣的比對的真實例子在圖2中顯示，其中將來自變形肥桿菌的肌醇六磷酸酶(UNIPROT:Q6U677)與SEQIDNO:2的氨基酸1-413比對。A人這個比對可以推出，SEQIDNO:2的氨基酸119N、120L和121E分別對應于UNIPROT:Q6U677的119D、120I和120K,等等。不同的實施方案根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多肽具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列a)與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有至少78%同一性；并且b)在指定位置包含以下氨基酸中的至少一種1S、101、38S、66E、71K、81A、109Q、lllG、119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A，T、268A，T、277T、283D，E、285K、287D、288A，V、293G、296S、303L、314A、3371、345A、3501、364A、371K、372E、396P、399K、406E和/或413P。在上述b)中指定位置的每種氨基酸不同于布丘氏菌屬NCIMB41248野21生型肌醇六磷酸酶及其具有以下GENESEQP登錄號的變體AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。在其具體的實施方案中，所述氨基酸序列包含a)1S、101、38S、71K、109Q、111G、119N、120L、121E、152M、155E、193Q、255T、268A、277T、283E、285K、287D、288V、296S、364A、3501、372E和/或413P(i。通過SEQIDN0:4表示)中的至少一種;b)66E、81A、109Q、111G、119N、120L、121E、193Q、255A、268T、277T、283E、285K、287D、288V、293G和/或303L(如通過SEQIDNO:6表示)中的至少一種；和c)66E、109Q、111G、119N、120L、121E、141R、142L、155E、193Q、214V、239K、245D、248E、255A、283D、288A、314S、3371、345A、364A、371K、372E、396P、399K和/或406E(如通過SEQIDNO:2表示)中的至少一種。在另一具體的實施方案中，本發(fā)明的多肽在WO2006/043178中7>開的布丘氏菌屬野生型和突變體肌醇六磷酸酶的啟示下進行了變化，即所述多肽具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在指定位置包含以下氨基酸中的至少一種26E、37Y、89T、92E、1341,V、160R、164F、1711、176K、178P、188N、190E、192G、207E，T、209S、211C、235V、248L、256H，Y、261E、270K、303F和/或318D。K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、E248L、Q256H,Y、A261E、N270K、D283N、A288E、I303F和/或N318D。對SEQIDN0:2的成熟部分中的其它優(yōu)選取代是由SEQIDN0:4和6啟示的N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、T81A、R141Q、L142V、T152M、E155D、V2MI、K239N、D245E、E248S、A255T、R268A，T、A277T、D283E、N285K、T287D、A288V、D293G、P296S、1303L、S314A、B37V、A345S、V350I、A364S、K371N、E372Q、P396S、K399T、E406V和/或Q413P。作為另一個實例，將SEQIDN0:4的成熟部分突變以包含以下耳又^4中的至少一種K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、I303F和/或N318D。SEQIDN0:2的成熟部分中的其它優(yōu)選取代是由SEQIDNO:2和6啟發(fā)的S1N、19V、S38T、Q66E、K71Q、T81A、Q141R、V142L、M152T、E155D、1214V、N239K、E245D、S248E、T255A、A268R,T、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、D293G、S296P、1303L、A314S、V337I、S345A、1350V、A364S、N371K、E372Q、S396P、T399K、V406E和/或P413Q。在更進一步的實例中，將SEQIDNO:6的成熟部分突變以包含以下取代中的至少一種K26E、N37Y、A89T、D92E、T134I,V、H160R、S164F、T17U、T176K、A178P、S188N、D190E、A192G、K207E，T、A209S、D211C、A235V、S248L、Q256H,Y、A261E、N270K、E283N、V288E、L303F和/或N318D。SEQIDNO:2的成熟部分中的其它優(yōu)選取代是由SEQIDNO:2和4啟發(fā)的N1S、V9I、T38S、E66Q、Q71K、A81T、Q141R、V142L、T152M、D155E、1214V、N239K、E245D、S248E、A255T、T268A,R、T277A、E283D、K285N、D287T、V288A、G293D、P296S、L303I、A314S、V337I、S345A、V350I、S364A、N371K、Q372E、S396P、T399K、V406E和/或Q413P。如上文所解釋的，本發(fā)明不同的方面涉及"具有"如下氨基S銀列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和/或SEQIDNO:6的氨基酸1-413具有詳明的同一性程度，所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性(下文的"同源多肽")；或者涉及"具有"如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列以最大數(shù)目的氨基酸區(qū)別于SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413和SEQIDNO:6的氨基酸1-413。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413中的任何一個；或它們的等位變體(allelicvariant);或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413中的氨基酸序列；或它們的等位變體(allelicvariant);或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段組成。SEQIDNO:l、3和5的核苦酸序列中的任何一個，或其亞序列，以及SEQIDNO:2、4和6的氨基酸序列，或其片段，可以用于設計核酸探針以23根據(jù)本領域公知的方法從不同屬或種的菌4朱鑒定和克隆編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。具體而言，這樣的探針可以用于根據(jù)標準Southern印跡流程與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，從而從中鑒定并分離相應的基因。DNA和RNA探針均可使用。通常對探針進行標記用于4全測相應的基因(例如，用"P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白進行標記)。因此，可以從制備自這類其它生物的基因組DNA文庫篩選與上述探針雜交并且編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。來自這類其它的生物的基因組DNA或其它DNA可以通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術分開?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO:l、3或5或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中4吏用載體材料。在優(yōu)選的實施方案中，核酸探針包含SEQIDNO:l的核苦酸454-462、SEQIDNO:3的核苦酸384-392或SEQIDNO:5的核苷酸454-462(全部對應于基序119N、120L和121E)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2、4或6中任何一個的多肽或其亞序列的多核苷酸序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:l、3或5。本發(fā)明還涉及變體，所述變體在SEQIDNO:2的氨基酸1-413、SEQIDNO:4的氨基酸1-413或SEQIDNO:6的氨基酸1-413,或其成熟多肽中包含一個或多個氨基酸的保守取代、缺失和/或插入。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是不重要的(ofaminornature),即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常為1至大約30個氨基酸；小的氨基或，復基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸區(qū)(tract)、抗原表位或結合域。如上所述，片段是包含缺失的變體的優(yōu)選實例，并且片段優(yōu)選保持肌醇六磷酸酶活性。保守取代的實例是在以下組內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificacitivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neurath和R丄.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最常發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20種標準氨基酸，也可以使用非標準氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)取代野生型多肽的氨基酸殘基?？梢杂糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質(zhì)合成之后經(jīng)過修飾，和/或在它們的側鏈中具有不同于標準氨基酸的化學結構。非天然氨基酸可以通過化學方法合成，并且優(yōu)選地，是商業(yè)上可以獲得的，并且包括六氫吡啶羧酸、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸、和3，3-二曱基脯氨酸。親本多肽中的必需氨基酸可以依照本領域已知的方法鑒定，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變法(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081-1085)。在后一技術中，向分子中的每個殘基引入單一丙氨酸突變，并且測試所得突變分子的生物活性(即，肌醇六磷酸酶活性)以鑒定對于所述分子的活性而言關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。定，如通過以下這些技術如核》茲共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，結合對推定^l妻觸位點氨基酸的突變來加以測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。也可以從分析與本發(fā)明多肽的相關多肽的同一性來推斷必需氨基酸的身份。可以使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后進行有關的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988，Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來實現(xiàn)和測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991,Biochem.30:10832-10837;美國專利第5,223,409號；WO92/06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。誘變/改組方法可以與高通量、自動化篩選方法組合以4企測宿主細胞表達的克隆的、經(jīng)誘變多肽的活性。使用本領域的標準方法能夠從宿主細胞回收25編碼活性多肽的經(jīng)誘變DNA分子并且快速測序。這些方法允許迅速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于結構未知的多肽。本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，術語"獲得自"如用于本文與給定來源有關時應該是指由核苦酸序列編碼的多肽是由所述來源產(chǎn)生的，或是由已經(jīng)插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌抹產(chǎn)生的。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。在一個具體的實施方案中，所述多肽能夠獲得自變形細菌(Proteobacteria);y變形細菌(Gammaproteobacteria);腸桿菌目(Enterobacteriales);腸桿菌牙牛(Enterobacteriaceae);優(yōu)選來自布丘氏菌屬，例如選自以下種鄉(xiāng)間布丘氏菌(Buttiauxellaagrestis)、布里納氏布丘氏菌(Buttiauxellabrennerae)、費拉格布丘氏菌(Buttiauxellaferragutiae)、伽瓦尼布丘氏菌、1尹查德氏布丘氏菌(Buttiauxellaizardii)、諾基亞布丘氏菌(Buttiauxellanoackiae)、瓦姆波德布丘氏菌(Buttiauxellawarmboldiae)、布丘氏菌屬菌種B22、布丘氏菌屬菌種BTNOl、布丘氏菌屬菌種LBV449、布丘氏菌屬菌種P5、布丘氏菌屬菌種PNBS、布丘氏菌屬菌種S212、布丘氏菌屬菌種S215、布丘氏菌屬菌種S218。http:〃/Taxonomy/Browser。在更優(yōu)選的方面，多肽是伽瓦尼布丘氏菌或鄉(xiāng)間布丘氏菌多肽，最優(yōu)選是伽瓦尼布丘氏菌DSM18930、鄉(xiāng)間布丘氏菌DSM18931或鄉(xiāng)間布丘氏菌DSM18932多肽。將會理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamo卬h),無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌抹在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmdcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究才幾構專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中'"(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選其它微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核芬酸。一旦用所述探針;險測到編碼多肽的多核苦酉拼列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989,見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中將另一多肽融合在所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)融合來產(chǎn)生融合的多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術是本領域已知的，并且包括將編碼所述多肽的編碼序列連接，從而使它們符合讀框并且使融合的多肽的表達在相同的啟動子和終止子的調(diào)控下。l務改的性質(zhì)在本發(fā)明的任何方面的具體實施方案中，肌醇六磷酸酶具有修改的，優(yōu)選是改進的性質(zhì)。修改的，優(yōu)選改進的性質(zhì)的實例是pl、溫度和/或pH穩(wěn)定性、pH活性譜、溫度活性譜、底物譜和在體外或體內(nèi)的在動物飼料中的性能。術語'M務改"和"改進'，意指與另一肌醇六磷酸酶相比較。這些另外的參照或比較的肌醇六磷酸酶的實例是布丘氏菌屬NCIMB41248野生型肌醇六磷酸酶及其具有以下GENESEQP登錄號的變體AEH25051、AEH25056、AEH25057、AEH25058、AEH25059、AEH25060、AEH25061、AEH25062、AEH25063、AEH25064、AEH25065、AEH25066、AEH25067、AEH25068、AEH25069、AEH25070、AEH25071、AEH25072、AEH25073、AEH25074、AEH25075和AEH25076。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在指定位置包含以下氨基酸中的至少一種119N、120L和/或121E，如實驗部分所示，所述本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有改進的比活性。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶包含i)119N;ii)121E;iii)120L;iv)119N和121E;v)119N和120L;vi)121E和120L;或vii)119N、120L和121E。在更進一步的具體實施方案中，i)-vii)的肌醇六磷酸酶具有改進的比活性。比活性如下所述測定。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在指定位置包含以下氨基酸中的至少一種109Q和/或111G，預期所述本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有改進的穩(wěn)定性，特別是改進的熱穩(wěn)定性。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶包含i)111G;ii)109Q;或iii)111G和109Q。在更進一步的實施方案中，i)-iii)的肌醇六磷酸酶具有改進的穩(wěn)定性，優(yōu)選是改進的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性如下所述測定。還預期包含193Q的本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有改進的穩(wěn)定性，優(yōu)選具有改進的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性如下所述測定。在指定位置的其它特定氨基酸，以及其它特定氨基酸取代也在本文中公性質(zhì)例如pl、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、pH活性譜、溫度活性譜、底物語和/或改進的在體外或體內(nèi)在動物飼料中的性能。比活性在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶相對于參照肌醇六磷酸酶具有改進的比活性。更具體地，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的比活性相對于用同樣方法測定的參照肌醇六磷酸酶的比活性是至少105%。在更進一步的具體實施方案中，相對比活性是至少110、115、120、125、130、140、145、150、160、170、180、l卯、200、220、240、260、280、300、350或甚至400%,仍是相對于用同樣方法測定的參照肌醇六磷酸酶的比活性而言。參照肌醇六磷酸酶的實例在上文列出。對于這種實施方案優(yōu)選的參照肌醇六磷酸酶是GENESEQP:AEH25072(WO2006/043178的表3中公開的變體)和GENESEQP:AEH25051(WO2006/043178的實施例10中公開的來自布丘氏菌屬P1-29的野生型肌醇六磷酸酶)。在替換方案中，術語高比活性是指至少240FYT/mg酶蛋白(EP)的比活性。在一個具體的實施方案中，比活性是至少300、350、400、450、500、550、600或至少650FYT/mgEP。比活性是對高度純化的樣品(SDS聚丙烯酰胺凝膠應該顯示只有一個組分存在)測量的。優(yōu)選地，如通過SDS測定，酶樣品是至少95%純的。酶蛋白濃度可以通過氨基酸分析來測定，并且肌醇六磷酸酶活性以FYT為單位，如實施例3中所述測定，即在pH5.5和37。C對肌醇六磷酸鈉底物測定。比活性是所述的特定肌醇六磷酸酶的特征，并且計算為以每mg肌醇六磷酸酶變體酶蛋白的FYT單位測量的肌醇六磷酸酶活性。進一步的細節(jié)參見實施例4。等電點(pl)28在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的pi范圍是i)7.0-8.0;ii)7.2-7.8;或iii)7.4-7.6。pi如實施例5中所述測定。pH譜在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與對照肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH譜。對照肌醇六磷酸酶的實例在上文列出。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在pH2.0具有的相對活性是在pH4.5(最適pH)的活性的至少30%，優(yōu)選至少31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%或至少41%。在其它具體實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在pH6.0具有的相對活性是在pH4.5(最適pH)的活性的至少10%，優(yōu)選至少15%、20%、25%、30%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%或至少43%。pH譜(肌醇六磷酸酶活性作為pH的函數(shù))是對高度純化的樣品(SDS聚丙烯酰胺凝膠應該顯示只有一個組分存在)測定的。優(yōu)選地，如通過SDS測定，酶樣品是至少95%純的。使用混合緩沖液(buffercocktail)(50mM甘氨酸、50mM乙酸和50mMBis-Tris(二-(2-羥乙基)亞氨基-三(羥曱基)曱烷(Bis陽(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methan))在2.0-7.5的pH范圍測定肌醇六磷酸酶活性，并且在pH5.5和37。C對肌醇六磷酸鈉底物進行。優(yōu)選的測定法是實施例3的測定法，只是將緩沖液替換為上文指定的緩沖液。更多細節(jié)參見實施例6。pH穩(wěn)定性在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參照肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH穩(wěn)定性。參照肌醇六磷酸酶的實例在上文列出。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在40。C和選自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH溫育1W小時之后，相對于0小時(溫育開始之前)的肌醇六磷酸酶活性，具有至少50%的殘余肌醇六磷酸酶活性，優(yōu)選至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、84%、86%、90%、92%或至少94%的殘余肌醇六磷酸酶活性。在優(yōu)選的實施方案中，溫育pH是i)2.0,ii)3.0，iii)4.0,iv)5.0，v)6.0，vi)7.0,和vii)8.0。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，溫育pH是2.0,并且殘余活性是至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%,或至少82%。將肌醇六磷酸酶在調(diào)節(jié)至期望的pH的0.1M甘氨酸、0.1M乙酸、0.1MBis-Tris中溫育。在pH5.5和37。C測定對肌醇六磷酸鈉底物的肌醇六磷酸酶活性。實施例3的活性測定法，其中將緩沖液替換成上文指定的緩沖液，是優(yōu)選的測定法。更多細節(jié)參見實施例7。在更進一步的具體實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在40。C和選自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH溫育24小時之后，相對于0小時(溫育開始之前)的肌醇六磷酸酶活性，具有至少50%的殘余肌醇六磷酸酶活性，優(yōu)選至少51%、52%、54%、56%、58%、60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、82%、84%、86%，或至少88%的殘余肌醇六磷酸酶活性。在優(yōu)選的實施方案中，溫育pH是i)2.0，ii)3.0,iii)4.0，iv)5.0,v)6.0,vi)7.0，和vii)8.0。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，溫育pH是2.0，并且殘余活性是至少50%、51%、52%、54%,或至少56%。將肌醇六磷酸酶在調(diào)節(jié)成期望pH的O.IM甘氨酸、0.1M乙酸、O.lMBis-Tris中溫育。在pH5.5和37。C測定對肌醇六磷酸鈉底物的肌醇六磷酸酶活性。實施例3的活性測定法，其中將緩沖液替換成上文指定的緩沖液，是優(yōu)選的測定法。更多細節(jié)參見實施例7。溫度語在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參照肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH穩(wěn)定性。參照肌醇六磷酸酶的實例在上文列出。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在30。C具有的相對活性是在60°C(最適溫度)的活性的至少20%，優(yōu)選至少22%、24%、26%、28%、30%、32%、34%、36%、38°/。，或至少40%。在另外的具體實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在70。C具有的相對活性是在60。C(最適溫度)的活性的至少10%,優(yōu)選至少12%、14%、16%、18%、20%、22%,或至少23%。溫度譜(肌醇六磷酸酶活性作為溫度的函數(shù))是對高度純化的樣品(SDS聚丙烯酰胺凝膠應該顯示只有一個組分存在)測定的。優(yōu)選地，如通過SDS測定，酶樣品是至少95%純的。肌醇六磷酸酶活性是在pH4.0,或在pH5.5,在20-90。C的溫度范圍測定的。在兩種情況下均^f吏用0.25M乙酸鈉緩沖液。活性是對肌醇六磷酸鈉底物測定的。優(yōu)選的測定法是實施例3的測定法，當然除了溫度不同，并且如果期望，pH也不同，參照上文。更多細節(jié)參見實施例8。熱穩(wěn)定性在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶與參照肌醇六磷酸酶相比具有修改的，優(yōu)選改進的熱穩(wěn)定性。參照肌醇六磷酸酶的實例在上文列出。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶在pH4.5在高溫(如65、70、75、80、85、90或95。C)溫育期望的時間(如15分鐘、30分鐘、1小時、P/2小時或2小時)之后，相對于O小時(溫育開始之前)的肌醇六磷酸酶活性，具有至少50%的殘余肌醇六^#酸酶活性，優(yōu)選至少55%、60%、65%、70%、75%、800/。、82。/()、84%、86。/o、90。/o、92o/o，或至少94%。在優(yōu)選的實施方案中，溫育時間是l小時，pH是4.5且溫度是80。C。將肌醇六磷酸酶在0.25M乙酸鈉中溫育。在pH5.5和37。C測定對肌醇六磷酸鈉底物的肌醇六磷酸酶活性。實施例3的活性測定法是優(yōu)選的測定法?；蛘撸梢允褂貌钍緬呙枇繜岱?DSC)測量法來測定純化肌醇六磷酸酶蛋白的變性溫度Td。Td可指示蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性Td越高，熱穩(wěn)定性越高。DSC測量法可以在不同的pH值下進行，例如使用來自MicroCal的VP-DSC。掃描可以1.5。C/min的恒定掃描率在20-9(TC進行。優(yōu)選的pH值是4.0和5.5，優(yōu)選4.0。在運行DSC之前，將肌醇六磷酸酶脫鹽，例如使用在適當緩沖液(例如25mM乙酸鈉pH4.0;0.1M乙酸鈉，pH5.5)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)。數(shù)據(jù)處理使用MicroCalOrigin軟件(版本4.10)進行，并且將變性溫度Td(也稱為解鏈溫度，Tm)定義為溫語圖(thermogram)中峰頂?shù)臏囟取Ｔ谝粋€具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有至少60。C的Td,可以如上所述測定。在更進一步的具體實施方案中，Td是至少61、62、64、66、68、70、72、74、76、78,或至少80°C。在動物飼料中的性能在具體實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶如與參照肌醇六磷酸酶相比具有改進的在動物飼料中的性能。參照肌醇六磷酸酶的實例在上文列出。在動物飼料中的性能可以使用模擬單胃動物中胃腸環(huán)境的體外模型測定，例:^i。下飼料樣品的組成為30%大豆粉和70%玉米粉，并添加CaCl2至每kg飼料5g鈣的濃度，制備所述飼料樣品并且在40。C和pH3.0預溫育30分鐘，其后添加胃蛋白酶(3000U/g飼料)和合適劑量的肌醇六磷酸酶(對全部待測試的肌醇六磷酸酶使用相同的劑量以允許比較)，例如，0.25-0.75肌醇六磷31酸酶單位FYT/g飼料。還包括一個無肌醇六磷酸酶活性的空白作為參照。其后將樣品在40。C和pH3.0溫育60分鐘，接著在pH4.0溫育30分鐘。終止反應，然后通過添加HC1至終濃度0.5M并在40。C溫育2小時來提取肌醇六磷酸和肌醇-磷酸(inositol-phosphates),其后進行一個凍融循環(huán)，再在40。C溫育1小時。月幾醇六石粦酸和月幾醇畫石粦酸通過如Chen等在JournalofChromatographyA(2003)1018巻，41-52頁中所述的高效離子層析來分離，并且如Skoglund等于J.Agric.FoodChem.(1997)，45巻，431-436頁中所述定量。然后計算用肌醇六磷酸酶處理的樣品和未處理的樣品之間的肌醇-磷酸結合的磷(IP-P)的差異作為釋放的磷。計算指定的肌醇六磷酸酶相對于期望的參照肌醇六磷酸酶的釋放的磷的百分比作為指定的肌醇六磷酸酶的相對性能。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的體外相對性能是至少105%,優(yōu)選至少110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200%。多核苷酸、核酸構建體和表達載體本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸優(yōu)選是基本上純的(substantiallypure)或是分離的，這是指不含其它外源或不想要的核苷酸的多核苷酸制備物，并且是以適合在基因工程化的蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有最多10%,優(yōu)選最多8%,更優(yōu)選最多6%,更優(yōu)選最多5%,更優(yōu)選最多4%,更優(yōu)選最多3%,甚至更優(yōu)選最多2%,最優(yōu)選最多1%,并且甚至最優(yōu)選最多0.5%的與其天然結合的其它多核苷酸物質(zhì)。然而，基本上純的多核苦酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選所述基本上純的多核苷酸按重量計是至少90%純的，優(yōu)選至少92%純的，更優(yōu)選至少94%純的，更優(yōu)選至少95%純的，更優(yōu)選至少96%純的，更優(yōu)選至少97%純的，甚至更優(yōu)選至少98%純的，最優(yōu)選至少99%,并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選本文公開的多核苷酸是"基本上純的形式(essentiallypureform)",即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然結合的其它多核苷酸物質(zhì)。在本文中，術語"基本上純的多核苷酸"與術語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核香酸"同32義。多核苷酸可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成、合成來源，或它們的任意組合。本發(fā)明還涉及核酸構建體，所述構建體包含本發(fā)明的分離的多核苦酸，其與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞內(nèi)在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。術語"核酸構建體"如用于本文是指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或者修飾所述核酸分子以使其以本來不存在于自然界中(wouldnototherwiseexistinnature)的方式含有核酸的區(qū)4更。當核酸構建體包含表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術語核酸構建體與術語"表達盒，，(expressioncassette)同義。術語"調(diào)控序列'，在本文定義為包括對于編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。對于編碼多肽的核苷酸序列而言每個調(diào)控序列可以是天然的或外源的。這樣的調(diào)控序列包括，但不限于，前導序列，多腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子，和轉(zhuǎn)錄的和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核香酸序列編碼區(qū)的連接。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄校涫怯伤拗骷毎R別用于表達編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的核苷S殳序列。用于指導本發(fā)明的核酸構建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從以下獲得的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)a-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核|3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731》以及tac啟動子(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另American,1980,242:74-94;和Sambrook等'1989，見上文中描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與