基因工程重組DNA導入受體細胞

關于基因工程重組DNA導入受體細胞1、轉化概念轉化

：DNA重組分子在體外構建完成后，必須導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統稱為重組DNA分子的轉化（Transformation）。重組DNA人工導入受體細胞有許多方法，包括轉化、轉染、接合以及其它物理手段，如受體細胞的電穿孔和顯微注射等，這些導入方法在DNA重組技術中統稱為轉化操作。一、重組DNA轉化第2頁,共91頁，2024年2月25日，星期天感受態(tài)：受體細胞最易接受外源DNA片段而實現轉化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細菌，其吸收轉化因子的能力為一般細菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。第3頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、細菌轉化的步驟：感受態(tài)的形成。感受態(tài)時細胞表面出現各種蛋白質和酶類，負責轉化因子的結合、切割及加工。感受態(tài)細胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是與細胞表面受體結合，誘導某些與感受態(tài)有關的特征性蛋白質（如細菌溶素）的合成，使細菌胞壁部分溶解，局部暴露出細胞膜上的DNA結合蛋白和核酸酶等。轉化因子的結合。受體菌細胞膜上的DNA結合蛋白可與轉化因子的雙鏈DNA結構特異性結合，單鏈DNA或RNA雙鏈RNA以及DNA/RNA雜合雙鏈都不能結合在膜上。第4頁,共91頁，2024年2月25日，星期天轉化因子的吸收。雙鏈DNA分子與結合蛋白作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而另一條鏈則被吸收到受體菌中。整合復合物前體的形成。進入受體細胞的單鏈DNA與另一種游離的蛋白因子結合，形成整合復合物前體結構，它能有效地保護單鏈DNA免受各種胞內核酸酶的降解，并將其引導至受體菌染色體DNA處。轉化因子單鏈DNA的整合。供體單鏈DNA片段通過同源重組，置換受體染色體DNA的同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈DNA結構。第5頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共91頁，2024年2月25日，星期天二、受體細胞受體細胞(receptorcell)：又稱為宿主細胞(hostcell)，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞感受態(tài)(competence)：是指細菌吸收外源DNA的生理狀態(tài)。感受態(tài)細胞(competencecell)：是指具有接受外源DNA能力的細胞。第7頁,共91頁，2024年2月25日，星期天1、原核生物細胞的優(yōu)點大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結合的蛋白質，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩基因組簡單，不含線粒體和質體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。原核生物多數為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。第8頁,共91頁，2024年2月25日，星期天原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質折疊復性系統，即使許多真核生物基因得以表達，得到的也多是無特異性空間結構的多肽鏈。原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質加工系統，而許多真核生物蛋白質的生物活性正是依賴于其側鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核生物細胞內源性蛋白酶易降解空間構象不正確的異源蛋白，造成表達產物不穩(wěn)定等。2、原核生物細胞表達真核生物基因存在的缺點：第9頁,共91頁，2024年2月25日，星期天3、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌等。大腸桿菌受體細胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統。優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內毒素可導致人體熱原反應。第10頁,共91頁，2024年2月25日，星期天枯草桿菌受體細胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點：枯草桿菌具有胞外酶分泌－調節(jié)基因，能將具有表達的產物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達產物的提取和加工處理等，而且在大多數情況下，真核生物的異源重組蛋白經枯草桿菌分泌后便具有天然的構象和生物活性?？莶輻U菌不產生內毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌。枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調控、分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點。應用：已成功的用于表達人的β干擾素、白細胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等。第11頁,共91頁，2024年2月25日，星期天藍細菌（藍藻）藍藻——又稱藍綠藻或藍細菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統Ⅰ(PSⅠ)

和光合系統Ⅱ(PSⅡ)、能進行光合作用，但它又具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結構的細胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，具體表現在：基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢測。第12頁,共91頁，2024年2月25日，星期天細胞壁屬G-，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。多種藍藻含內源質粒，為構建藍藻質粒載體提供了極好的條件。藍藻富含蛋白質，并且多數藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎上采用轉基因技術，把一些重要藥物的基因轉入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。第13頁,共91頁，2024年2月25日，星期天4、真核生物細胞真菌受體細胞真菌是低等的真核生物，其基因結構、表達調控機制以及蛋白質的加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細胞表達高等動植物基因具有原核生物細胞無法比擬的優(yōu)點。第14頁,共91頁，2024年2月25日，星期天酵母菌酵母菌作為外源真核基因表達系統的優(yōu)點酵母菌是結構最為簡單的真核生物之一,其基因表達調控機理比較清楚,遺傳操作相對較為簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統。不含有特異性的病毒，不產生毒素，有些酵母菌屬(如釀酒酵母)在儀器工業(yè)中有著幾百年的應用歷史，屬于安全型基因工程受體系統。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產，成本低廉。能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中，便于產物的提取和加工等。第15頁,共91頁，2024年2月25日，星期天動物細胞常用的動物受體細胞有Hela細胞、猴腎細胞和中國倉鼠巢細胞(CHO)等。哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點是：能識別和除去外源真核基因中的內含子，剪接加工成成熟的RNA。真核基因表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾,產物具有較好的蛋白質免疫原性,約為酵母細胞16-20倍。第16頁,共91頁，2024年2月25日，星期天易被重組DNA質粒轉染,具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。經轉化的動物細胞可將表達產物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點是:組織培養(yǎng)技術要求高，如培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉化子CHO細胞，通常需要數月之久,難度較大。第17頁,共91頁，2024年2月25日，星期天目前用作基因轉移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經濟動物和鼠、猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達生產天然狀態(tài)的復雜蛋白質或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。常用的動物受體細胞有小鼠L細胞、Hele細胞猴腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等。以動物細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點第18頁,共91頁，2024年2月25日，星期天植物受體細胞優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA分子?，F在用作轉基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經濟作物和擬南芥等模式植物。第19頁,共91頁，2024年2月25日，星期天5、選擇受體細胞的基本原則便于重組DNA分子的導入。便于重組體的篩選。根據所用的表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進行篩選。遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大培養(yǎng)或易于進行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

第20頁,共91頁，2024年2月25日，星期天受體細胞內內源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產物在細胞內積累，可促進外源基因高效分泌表達。安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細胞或營養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞。第21頁,共91頁，2024年2月25日，星期天能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。從受體細胞的角度出發(fā)，通常的做法是對其作適當的修飾改造，如選用某些限制性核酸內切酶缺陷型的受體細胞就可以避免其對重組DNA分子的降解破壞作用。受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性。具有較好的轉譯后加工機制等，便于真核目的基因的高效表達。在理論研究和生產實踐上有較高的應用價值。第22頁,共91頁，2024年2月25日，星期天6、受體細胞應具備的條件野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，因為自身具有的限制和修飾系統，另外還可能存在潛在的致病性因此必須通過適當的誘變手段對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株通常應從以下幾個方面加以考慮：從安全性考慮，應具備以下條件：不適合在人體內生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存在非培養(yǎng)條件下，其DNA容易解體它的DNA不易轉移它的質粒只在這一宿主由復制便于檢測第23頁,共91頁，2024年2月25日，星期天從遺傳性考慮：重組缺陷型recA－，用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）限制系統的缺陷，或是修飾系統的缺陷。避免對外源DNA的除解。外切酶和內切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）

與重組質粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與載體選擇標記互補的表型）具有較高的轉化效率第24頁,共91頁，2024年2月25日，星期天限制缺陷型這是導致外源重組DNA轉化或轉導效率低下的主要原因之一。應選用限制系統缺陷型的突變菌株作為受體細胞，以提高外源DNA分子的轉化或轉導效率。進一步使修飾系統也發(fā)生缺陷，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。大腸桿菌的限制系統主要由hsdR基因編碼，因此具有hsdR-遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了降解外源DNA的能力，同時大大增加了外源DNA的可轉化性。第25頁,共91頁，2024年2月25日，星期天重組缺陷型進入野生型細胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內同源重組反應由rec基因家族的編碼產物所控制。RecA蛋白能促進DNA分子之間的同源聯會和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細胞內的遺傳重組頻率降低至106。大腸桿菌的recB、recC和recD基因分別編碼不同分子量的多肽鏈，三者構成一個在同源重組中的統一功能單位—RecBCD蛋白（核酸酶V），它具有依賴于ATP的雙鏈DNA外切酶和單鏈DNA內切酶雙重活性。recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率因此受體細胞必須選擇體內同源重組缺陷型的遺傳表型基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。第26頁,共91頁，2024年2月25日，星期天轉化親和型可以利用遺傳誘變技術改變受體菌細胞壁的通透性及細胞膜的特異吸附性，從而提高其轉化效率。還可以選擇能夠誘導形成感受態(tài)細胞的菌株作為受體菌細胞。第27頁,共91頁，2024年2月25日，星期天遺傳互補型遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細胞呈現與載體所攜帶的選擇標記互補的遺傳性狀。方能使轉化細胞的篩選成為可能。如在大腸桿菌系統中，重組質粒載體上多含有AMP抗性標記基因，則所選用的受體細胞應對這種抗生素敏感。當重組DNA分子轉入受體細胞后載體上的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特征，據此可以區(qū)分轉化子與非轉化子。如果受體細胞具有與外源基因表達產物活性互補的遺傳特征．可以直接篩選到外源基因表達的轉化細胞。第28頁,共91頁，2024年2月25日，星期天感染寄生缺陷型相當多的細菌對其它生物尤其是人和牲畜具有感染和寄生效應，重組DNA分子導入這些細菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生作用，進入生物體內，并廣泛圍傳播，如果外源基因對人體和牲畜有害，則會導致一場災難，因此從安全的角度上考慮，受體細胞不能具有感染寄生性，當然，利用基因工程手段制造生物武器不在此例。第29頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共91頁，2024年2月25日，星期天三、重組DNA導入受體細胞的方法轉化(transformation):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲質粒DNA或以它為載體構建的重組質粒DNA分子的過程。轉化子(transformant)：經轉化獲得外源遺傳物質的細胞。轉染(transfection):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲噬菌體或以它為載體構建的重組DNA分子的過程轉導(transduction):指病毒轉移真核細胞DNA的過程或噬菌體介導的細菌細胞之間基因轉移的過程。第31頁,共91頁，2024年2月25日，星期天基因導入受體細胞方法根據轉移基因方法特性可分為：轉化(transformation)轉導(transduction)轉染(transfection)微注射技術(microinjection)電轉化法(electroporation)基因槍技術(geneblaster)脂質體介導法(liposomemediatedtransfer)第32頁,共91頁，2024年2月25日，星期天根據轉移基因載體與受體的特性可分為：質粒載體導入受體細胞的方法：CaCl2、電轉化法等。噬菌體轉染細胞的方法：體外包裝感染法等。DNA導入酵母菌的方法：原生質體轉化、電穿孔轉化法等。DNA導入植物細胞的方法：Ti質粒葉盤法、電穿孔轉化法、基因槍法等。DNA導入昆蟲細胞的方法：桿狀病毒感染法等。DNA導入哺乳動物細胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉化法、脂質體介導法、基因槍法等第33頁,共91頁，2024年2月25日，星期天1、氯化鈣轉化法大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉化，其主要原因是轉化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應用中，轉化受體菌細胞的正是根據人們需要構建的外源重組質粒DNA分子而非來自供體菌的游離DNA片段(轉化因子)。因此在大腸桿菌的轉化實驗中，很少采取自然轉化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉化處理，其中代表性的方法之一是Ca2+誘導的大腸桿菌轉化法。第34頁,共91頁，2024年2月25日，星期天1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現,大腸桿菌經過氯化鈣適當處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學S.Cohen報道,經氯化鈣處理大腸桿菌細胞也能攝取質粒DNA。第35頁,共91頁，2024年2月25日，星期天Ca2+誘導轉化原理：①在0℃的Cacl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細胞膜磷脂層形成液晶結構促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。②Ca2+能與加入的DNA分子結合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當42℃熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結構發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現許多間隙，為DNA分子提供了進入細胞的通道。第36頁,共91頁，2024年2月25日，星期天Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNA的轉化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉化效率可提高100～1000倍，且對大小質粒分子均可進行有效的轉化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。第37頁,共91頁，2024年2月25日，星期天該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉化如果感受態(tài)細胞做得好，每微克超螺旋質粒DNA可得5×107～1×109個轉化子。第38頁,共91頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體。用10ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體。用1ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體。冰浴放置12-24小時，備用。取100ml感受態(tài)細胞，加入相當于50ng載體的重組DNA連接液，混勻。第39頁,共91頁，2024年2月25日，星期天冰浴放置半小時。在42℃保溫1.5分鐘（熱脈沖）?？焖賹⑥D化細胞轉移至冰浴中放置1–2分鐘。加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時（擴增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。

第40頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共91頁，2024年2月25日，星期天獲得合格的感受態(tài)細胞，要注意以下幾點：用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在A600為0.4左右為好。制備受體細胞的整個過程要在0～4℃進行，并盡量避免污染。如果用抗生素篩選轉化子，作為對照的受體菌應該在此培養(yǎng)基上不生長。為了提高轉化率，可選用復合氯化鈣溶液，如FSB溶液。第42頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共91頁，2024年2月25日，星期天CaCl2法制備感受態(tài)細胞轉化DNA時，低溫的主要目的是:（1）抑制細胞的旺盛生理代謝。（2）有助于DNA-Ca2+吸附于細胞表面。（3）防止DNAase降解DNA。熱休克溫度是42℃。目的是使細胞攝入吸附于其表面的DNA?！?4頁,共91頁，2024年2月25日，星期天轉化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉化子的出現，因此須設以下幾種對照處理：DNA對照處理。轉化處理液中用0.2ml無菌水代替0.2m1感受態(tài)細胞，檢驗DNA溶液是否染菌。感受態(tài)細胞對照處理。轉化處理液中用0.1mlNTE緩沖液(500mMNaCl，10mMTris-HCl，1mMEDTApH8.0)代替0.1m1DNA溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染菌。感受態(tài)細胞有效性對照處理。在0.2ml感受態(tài)細胞中加入0.1ml已知容易轉化這種感受態(tài)細胞的質粒DNA。第45頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、PEG介導的細菌原生質體轉化革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質體（細胞去壁后的形態(tài)）轉化的方法轉移質?；蛑亟MDNA分子。酵母菌、霉菌、植物細胞也可用原生質體法進行轉化。第46頁,共91頁，2024年2月25日，星期天PEG是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚體,它可改變各類細胞的膜結構,使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組,此時相互接觸的兩細胞的胞質溝通成為可能,從而造成細胞之間發(fā)生融合。第47頁,共91頁，2024年2月25日，星期天細菌原生質體的制備：不同細菌的原生質體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液），并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質體接觸的所有器皿應保持無水無去污劑。第48頁,共91頁，2024年2月25日，星期天細菌原生質體的轉化：取0.2-1ml的原生質體懸浮液（108-109個原生質體），加入10-20mlDNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻。細菌原生質體的再生：原生質體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內含脯氨酸和微量元素。第49頁,共91頁，2024年2月25日，星期天3、電轉化電轉化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質膜上形成納米大小的微孔，DNA直接通過這些微孔或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過質膜進入細胞質中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將DNA導入真核細胞,1988年,Dower等人成功應用于大腸桿菌的轉化。基本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道,從而促進外源DNA的有效吸收。

第50頁,共91頁，2024年2月25日，星期天將待轉化的質粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內。電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大。第51頁,共91頁，2024年2月25日，星期天電穿孔轉化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數的影響，通過優(yōu)化這些參數，每μgDNA可以得到109～1010轉化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉化效率將會有所提高，但同時導致受體細胞存活率的降低，轉化效率的提高也因此被抵消。第52頁,共91頁，2024年2月25日，星期天用于電穿孔轉化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備容易得多．當細菌生長到對數中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用10％甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3×l010個／m1。分裝，在干冰上速凍后置于-70℃貯存。這樣，每小份細胞融解后即可用于轉化，有效期達6個月以上。電穿孔轉化須在低溫下(0-4℃)進行，轉化效率要比在室溫下操作提高約100倍。第53頁,共91頁，2024年2月25日，星期天4、接合轉化：接合（Conjugation）：指通過細菌細胞之間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。這個過程是由結合型質粒完成的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導DNA分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼第54頁,共91頁，2024年2月25日，星期天是基于非接合型質粒的遷移作用而建立的一種DNA轉化方式．適用于那些難以采用Ca2+誘導轉化法或電穿孔法轉化的受體菌。非接合型質粒分子較小，缺少編碼質粒轉移體系所須的全部基因，不能象接合型質粒那樣在宿主細胞間自我轉移。但如果宿主細胞中存在另外一種溶合性的接合型質粒（即輔助質粒）非接合型質粒通常也會被轉移，這種由共存的接合型質粒引發(fā)的非接合型質粒的轉移過程稱為遷移作用第55頁,共91頁，2024年2月25日，星期天接合型質粒分子較大，自我轉移的隨意性強，轉移過程中經常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質粒載體多是在非接合型質?；蛉笔Я私雍限D移基因的接合型質粒的基礎上構建的，故重組質粒DNA分子也不能直接接進行接合轉化。而只能通過其遷移作用來完成。第56頁,共91頁，2024年2月25日，星期天首先將具有接合轉化功能的輔助質粒轉移至含有重組質粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉化作用，將重組質粒導入受體細胞。整個接合轉化過程涉及到3種有關的細菌菌株即待轉化的受體菌、含有要轉化的重組質粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉化法。第57頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共91頁，2024年2月25日，星期天5、重組λ噬菌體DNA分子轉導大腸桿菌

轉染：將重組λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞中的過程，稱為轉染。將重組λ噬菌體DNA分子導入大腸桿菌受體細胞的常規(guī)方法是轉導操作。轉導(transduction)：指通過λ噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉移到受體細胞內的過程。第59頁,共91頁，2024年2月25日，星期天具有感染能力的λ噬菌體顆粒除含有λ噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重組λ噬菌體DNA分子進行體外包裝。體外包裝，是指在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細胞內發(fā)生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術。第60頁,共91頁，2024年2月25日，星期天基本原理：根據λ噬菌體DNA體內包裝的途徑分別獲得缺失D包裝蛋白的λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的λ噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝λ噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝λ噬菌體DNA。第61頁,共91頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體DNA體外包裝的主要過程①制備包裝物。須培養(yǎng)兩種溶原菌誘導溶菌生長收集和貯存包裝物。②體外包裝。制備λ噬菌體DNA混合液。第一次包裝。包裝物剛融化時，細胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。第二次包裝。進行第二次包裝，可提高包裝效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包裝反應液的黏度，便于包裝反應的進行。去除細胞屑。第二次包裝后，在反應液中加入SM溶液（噬菌體稀釋緩沖液：100mmol/LNaCl,

10mmol/LMgSO4,

50mmol/LTris-HCLpH7.5)0.2%明膠和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。第62頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第63頁,共91頁，2024年2月25日，星期天經過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當的受體菌細胞，并將重組λ噬菌體DNA分子高效導入細胞中。在良好的體外包裝反應條件下，每μg野生型的λ噬菌體DNA可形成108～109的pfu。對于重組的λ噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達到106～107pfu，完全可以滿足構建真核基因組基因文庫的要求。第64頁,共91頁，2024年2月25日，星期天6、轉化率的計算及其影響因素轉化率：指DNA分子轉化受體菌獲得轉化子的效率。轉化率是衡量轉化效率的重要指標，有兩種表示方式：一是在待轉化DNA分子數大于受體細胞數的條件下，轉化細胞與細胞總數之比。二是在受體細胞數相對于待轉化DNA分子數大大過量時，每微克DNA轉化所產生的克隆數。也可表征為每微克DNA進入受體細胞的分子數第65頁,共91頁，2024年2月25日，星期天影響轉化率的因素載體及重組DNA方面載體本身的性質：不同的載體轉化同一株受體細胞，其轉化率不同。分子質量較小的重組質粒DNA分子轉化率較高，分子質量較大的重組質粒DNA分子轉化率較低，對于大于30kb的重組質粒則很難進行轉化。載體的空間構象：與受體細胞親和性較強的質粒載體轉化率要高于親和性較弱的質粒載體。質粒的超螺旋構象轉化率最高，經酶切連接操作后的載體由于空間構象難以恢復，一般要比新制備的超螺旋質粒低兩個數量級。插入片段大?。簩|粒載體而言，插入片段越大，轉化效率越低。重組DNA分子的濃度和純度：在10ng／100u1以下的DNA濃度范圍內，轉化效率與DNA分子數成正比關系。※第66頁,共91頁，2024年2月25日，星期天受體細胞方面：受體細胞必須與載體相匹配，如：pBR322轉化大腸桿菌JM83株，轉化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉化率則較高。轉化操作方面：受體細胞的預處理或感受態(tài)細胞的制備對轉化率影響最大對于Ca2+誘導的完整細胞轉化而言，菌齡、CaCl2處理時間感受態(tài)細胞的保存期以及熱脈沖時間均是很重要的因素，其中感受態(tài)細胞通常在12-24小時內轉化率最高，之后轉化率急劇下降。對于原生質體轉化而言，再生率的高低直接影響轉化率，而原生質體的再生率又受諸多因素的制約在一次轉化實驗中，DNA分子數與受體細胞數的比例對轉化率也有影響。電穿孔轉化法中，對受體細胞進行冰凍甘油預處理后的轉化率，要比不經此預處理的轉化率高10-100倍。第67頁,共91頁，2024年2月25日，星期天同一重組質粒DNA分子轉化不同的受體菌細胞，轉化率不同——受體細胞的選擇對于重組DNA分子的轉化也是極為重要。受體細胞的預處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導轉化0.1ml感受態(tài)細胞50ngDNA

原生質體轉化109個原生質體 50ngDNA

第68頁,共91頁，2024年2月25日，星期天提高轉化效率的幾個重要因素：

①細胞生長狀態(tài)和密度不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時，細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。第69頁,共91頁，2024年2月25日，星期天②質粒的質量和濃度:用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋DNA(cccDNA)轉化效率與外源DNA濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。第70頁,共91頁，2024年2月25日，星期天③試劑的質量所用的試劑，如CaCl2等均需是最高純度的，并用超純水配制（過濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4℃）。④防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管,槍頭等最好是新的，并經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入，為以后的篩選和鑒定帶來不必要的麻煩。第71頁,共91頁，2024年2月25日，星期天擴增操作轉化細胞的擴增操作：指轉化完成之后細胞的短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴增操作往往與轉化操作偶聯在一起，如：Ca2+誘導轉化后的37℃培養(yǎng)一個小時原生質體轉化后的再生過程λ噬菌體轉染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴增操作擴增操作的目的增殖轉化細胞，使得有足夠數量的轉化細胞用于篩選程序。擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選。表達外源基因，便于篩選和鑒定。四、轉化細胞的擴增第72頁,共91頁，2024年2月25日，星期天五、外源基因導入真核細胞的方法1．重組DNA分子導入酵母細胞：利用酵母的原生質球進行轉化

首先，酶解酵母細胞壁，產生原生質球，再將原生質球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中多聚醇可使細胞壁具有穿透性，并允許DNA進入然后使原生質球懸浮于瓊脂中，并使其再生新的細胞壁。第73頁,共91頁，2024年2月25日，星期天2、重組DNA分子導入哺乳動物細胞①病毒顆粒轉導法病毒種類多樣及病毒DNA或RNA構建的載體性質的各異，所以轉導的過程各不相同，主要有三種類型：一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細胞染色體DNA上這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。二，帶有目的基因的毒病是缺陷性的，須同另一輔助病毒一起感染受體細胞．在受體細胞內包裝成新的病毒顆粒。三，雖然帶目的基因的SV40病毒是早期轉錄缺陷型的但被感染的COS細胞系的基因組中整合有SV40早期轉錄區(qū)段DNA，所以沒有必要用輔助病毒作混合感染。第74頁,共91頁，2024年2月25日，星期天②磷酸鈣-DNA共沉淀法是指外源基因與磷酸鈣混合形成磷酸鈣-DNA共沉淀物，可使DNA附在細胞表面，通過細胞吞入攝取或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，這種轉染方法稱為磷酸鈣-DNA共沉淀法。其依據是哺乳動物細胞能捕獲黏附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉入細胞。第75頁,共91頁，2024年2月25日，星期天進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉導頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。DNA磷酸鈣共沉淀復合物中DNA的數量、共沉淀物與細胞接觸的保溫時間、以及DMSO和甘油等促進因子作用的持續(xù)時間均會影響DNA的轉染效率。此方法對于貼壁細胞轉染是最常用并首選的方法第76頁,共91頁，2024年2月25日，星期天第77頁,共91頁，2024年2月25日，星期天③DEAE-葡聚糖轉染法二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一種高分子質量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞捕獲外源DNA，實現短時間的有效表達。目前有關DEAE-葡聚糖的作用機制一般認為DEAE-葡聚糖能與外源DNA形成復合物，保護DNA免受核酸酶的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受體細胞膜，增加其通透性，便于DNA進入。此方法簡單、重復性高，并且轉染效率高于磷酸鈣法。第78頁,共91頁，2024年2月25日，星期天