GB-T基因表達(dá)的測(cè)定 蛋白印跡法征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明

一、任務(wù)來(lái)源

本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)為

20180920-T-424。本項(xiàng)目由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2019年完成。

本標(biāo)準(zhǔn)起草工作由河北醫(yī)科大學(xué)等單位共同完成。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的及意義

蛋白印跡法（Westernblot）是檢測(cè)混合樣品中單一特定蛋白的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)，蛋

白質(zhì)進(jìn)行變性凝膠電泳后，將其直接轉(zhuǎn)印到固相膜支持物進(jìn)行免疫反應(yīng)，是進(jìn)行

蛋白檢測(cè)和鑒定的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)工具，采用免疫或生物化學(xué)方法對(duì)結(jié)合在膜上的

蛋白進(jìn)行分析、定量染色，同時(shí)可以準(zhǔn)確闡述蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用以

及蛋白質(zhì)與耦聯(lián)體之間的相互作用。該技術(shù)集合凝膠上電泳分離的高分辨率和免

疫檢測(cè)特異性于一體，可以在復(fù)雜樣品中鑒定和檢測(cè)靶蛋白。蛋白印跡法在生命

科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的使用，適用于各種各樣的混合蛋白檢測(cè)：天然樣品中

提取的蛋白混合物、動(dòng)植物組織、微生物、血液、體液、培養(yǎng)的組織和細(xì)胞、基

因工程下游產(chǎn)品。用于各種蛋白的檢測(cè)有著特異靈敏、檢測(cè)簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠等等

很多優(yōu)勢(shì)。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則和依據(jù)

嚴(yán)格按照GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

的要求，制定該項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

四、主要工作過(guò)程

主要起草單位河北醫(yī)科大學(xué)開(kāi)展的主要工作過(guò)程如下：

1、2017年1月，組成標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，安排了工作進(jìn)度。

2、2017年1月~2017年3月，起草工作組查閱了國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于此方法

的規(guī)定，調(diào)研了國(guó)內(nèi)外有關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定方法的情況，起草了標(biāo)準(zhǔn)討論稿。

3、2017年4月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組對(duì)標(biāo)準(zhǔn)討論稿進(jìn)行了討論，形成第二輪標(biāo)

準(zhǔn)討論稿。

4、2017年5月，征求專家意見(jiàn)，形成第三輪標(biāo)準(zhǔn)討論稿。

5、2017年3月~2017年11月，對(duì)目前多種基因表達(dá)的測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證。

6、2017年12月，召開(kāi)標(biāo)準(zhǔn)研制推進(jìn)會(huì)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)研制過(guò)程中的問(wèn)題進(jìn)行討論，

商討解決方案。

7、2018年1月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組邀請(qǐng)專家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)討論稿提出意見(jiàn)。

8、2018年2月~2018年5月，進(jìn)一步對(duì)標(biāo)準(zhǔn)討論稿進(jìn)行修訂，形成標(biāo)準(zhǔn)草案。

9、2018年7月，本標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得立項(xiàng)。

10、2018年10月，完成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明的初稿。

11、2018年11月，完成第三方論證，召開(kāi)專家征求意見(jiàn)會(huì)，進(jìn)行充分討論，

進(jìn)一步根據(jù)專家意見(jiàn)修改和完善征求意見(jiàn)稿。

13、2018年12月~2019年2月，向全社會(huì)征求意見(jiàn)，并向中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)

科院、清華大學(xué)、北京大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)、首都醫(yī)科大學(xué)、河北省

食品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、河北師范大學(xué)、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院、

伯樂(lè)生物科學(xué)（中國(guó)）有限公司等高校、科研院所、企業(yè)、政府單位發(fā)函征求意

見(jiàn)。截至到2019年3月1日，共收到7封意見(jiàn)書，提出征求意見(jiàn)46條。編寫組對(duì)意

見(jiàn)進(jìn)行認(rèn)真研究，采納43條，未采納3條，并對(duì)文中相應(yīng)部分進(jìn)行了修改與完善，

形成了標(biāo)準(zhǔn)送審稿。

14、2019年5月，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院組織專家進(jìn)行審查。

五、主要技術(shù)內(nèi)容

在本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中，隨著研究的深入，先后完成標(biāo)準(zhǔn)討論稿、草案和標(biāo)準(zhǔn)

征求意見(jiàn)稿，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容不斷完善，并趨于科學(xué)合理。根據(jù)需要，本標(biāo)準(zhǔn)的主要技

術(shù)內(nèi)容確定為：

（一）前言部分。給出了標(biāo)準(zhǔn)的起草原則、歸口單位、起草單位及主要起草

人。

（二）范圍。給出了本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍。

（三）縮略語(yǔ)。給出了本標(biāo)準(zhǔn)中用到的縮略語(yǔ)。

（四）術(shù)語(yǔ)和定義。給出了本標(biāo)準(zhǔn)中用到的相關(guān)術(shù)語(yǔ)及其定義。

（五）試劑和材料。給出了本標(biāo)準(zhǔn)中用到的化學(xué)試劑、緩沖液、試劑盒等。

（六）儀器設(shè)備。給出了本標(biāo)準(zhǔn)所需的儀器和設(shè)備。

（七）主要技術(shù)內(nèi)容的說(shuō)明

1、蛋白樣品的選擇與準(zhǔn)備

陽(yáng)性樣品：真核細(xì)胞重組SM22蛋白

陰性樣品：SM22基因敲除小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞

測(cè)試樣品：動(dòng)物組織/細(xì)胞、植物組織/細(xì)胞

2、Westernblot分析特異性的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)選取真核細(xì)胞重組SM22蛋白作為陽(yáng)性樣品，SM22基因敲除小鼠原

代血管平滑肌細(xì)胞作為陰性樣品，進(jìn)行Westernblot分析，測(cè)定SM22的水平。

如Fig.1所示，左側(cè)陽(yáng)性樣品有特異性條帶，而右側(cè)陰性樣品未見(jiàn)任何條帶。提

示，Westernblot方法有著較強(qiáng)的特異性。

Fig.1Westernblot特異性分析

3、蛋白酶抑制劑對(duì)總蛋白提取的影響

本實(shí)驗(yàn)選取常見(jiàn)的蛋白酶抑制劑，按其說(shuō)明書濃度使用，以不加蛋白酶抑制

劑為對(duì)照，在相同條件下裂解小鼠胸腹主動(dòng)脈血管組織，結(jié)果見(jiàn)Fig.1。加入適量

的蛋白酶抑制劑，樣品放置于室溫1d，蛋白電泳后條帶依然比較完整（Fig.1A）；

未加入蛋白酶抑制劑，樣品放置于室溫1d，蛋白樣品有較大程度的降解（Fig.1B）。

表明，不同種類蛋白酶抑制劑均能保護(hù)蛋白不被降解。

AB

Fig.1蛋白酶抑制劑對(duì)總蛋白提取的影響

4、蛋白定量過(guò)程對(duì)Westernblot結(jié)果的影響

蛋白定量是對(duì)電泳前樣品的大致情況有所了解，在樣品的提取過(guò)程中，不同

樣品的蛋白量由于計(jì)算稱重偏差、提取操作中的損失等等可能引起樣品蛋白較大

的差異，如果未經(jīng)定量或定量不準(zhǔn)確，可能會(huì)影響結(jié)果的判斷。我們?nèi)〉润w積小

鼠胸腹主動(dòng)脈組織蛋白樣品進(jìn)行Westernblot分析，測(cè)定內(nèi)參GAPDH的水平。

如Fig.2所示，未經(jīng)定量的蛋白，因蛋白提取等操作中存在差異，導(dǎo)致上樣蛋白

量存在差異（Fig.2A）；通過(guò)定量結(jié)果調(diào)整上樣體積后，不同蛋白濃度的樣品，

上樣量可以保持一致（Fig.2B）。

A

B

Fig.2上樣量對(duì)結(jié)果判斷的影響

5、封閉液對(duì)條帶特異性的影響

本實(shí)驗(yàn)選取5%的脫脂牛奶作為封閉液，以不加封閉液組為對(duì)照，在相同條

件對(duì)小鼠胸腹主動(dòng)脈血管組織進(jìn)行Westernblot分析，測(cè)定SM22蛋白的水平，

結(jié)果見(jiàn)Fig.3。Fig.3A中未加封閉液，導(dǎo)致背景過(guò)高，嚴(yán)重影響結(jié)果判斷；Fig.3B

經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉1h，背景干凈、條帶清晰。結(jié)果提示，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，需將

對(duì)印跡膜上未被占據(jù)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉掉，以防止非特異性探針結(jié)合，如果沒(méi)

能將膜上位點(diǎn)全部封閉將會(huì)導(dǎo)致印跡膜出現(xiàn)較高的背景。

AB

Fig.3封閉對(duì)Westernblot結(jié)果的影響

六、驗(yàn)證情況及結(jié)果分析

為了進(jìn)一步完善和確定檢驗(yàn)方法，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組分別委托中國(guó)科學(xué)院、中

國(guó)農(nóng)科院、河北師范大學(xué)、河北省人民醫(yī)院和河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院五

家單位對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明該方法可靠、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，詳

細(xì)驗(yàn)證報(bào)告見(jiàn)附件。

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