干擾素制備的工藝流程

關于干擾素制備的工藝流程什么是干擾素？概念(interferon,IFN)：機體免疫細胞產生的一類細胞因子，是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過抗病毒應答反應而產生的一組結構類似、功能接近的生物調節(jié)蛋白。根據(jù)分子結構和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天α干擾素又依其結構分為α1b、α2a、α2b等亞型其區(qū)別在于個別氨基酸的差異上，早期干擾素是用病毒誘導人白血球產生的，產量低、價格昂貴，不能滿足需要，現(xiàn)在可利用基因工程技術并在大腸桿菌中發(fā)酵、表達來進行生產。第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天目的基因的分離克隆載體目的基因與克隆載體的體外重組→重組體導入大腸桿菌K12→受體菌的培養(yǎng)及篩選→從受體菌中獲取目的基因表達載體重組質粒導入大腸桿菌受體菌的篩選，表達性、穩(wěn)定性等檢測工程菌→基因工程菌的制備第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天一、目的基因的分離與獲得1.設計合成干擾素基因的兩端引物（完全的），每條引物內或5‘-端最好有內切酶酶切位點。2.有藥物誘導細胞，如佛波酯，使細胞表達干擾素升高。3.破碎細胞，提取細胞總mRNA.4.用逆轉錄試劑盒逆轉錄，把總mRNA逆轉錄成cDNA5.以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產物第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二、目的基因與克隆載體進行體外重組1.提取載體（質粒、病毒等），雙酶切，再把干擾素基因的PCR產物用相應的酶酶切，用連接酶連接EcoRIBamHIEcoRIBamHI2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對。3.鑒定序列無誤后（無義突變也行），導入受體細胞，篩選第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三、重組體引入宿主細胞

將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質粒pBR322中，轉化到大腸桿菌，重組的載體DNA分子在一定條件下轉化入大腸桿菌，形成攜帶質粒的菌株。第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天四、從大腸桿菌k12獲取目的基因

由于質粒重組時有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況流程：步驟一：將細菌涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可得到質粒PBR322或重組質粒的細菌單菌落。步驟二：步驟一獲得的每一個細菌單菌落標記為a、b、c、d等，在每一個單菌落中挑取部分細菌轉涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，不能生長的是絕大部分含有重組質粒的細菌及少量可能發(fā)生突變的非重組質粒的細菌單菌落。原因：因為PBR322含有抗四環(huán)素基因，重組質粒中目的基因插在抗四環(huán)素基因中，使其結構破壞，失去抗四環(huán)素作用。第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天五、提取重組質粒1、對上一步獲得含目的基因的大腸桿菌在含有氯霉素的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)15h。培養(yǎng)時間：前人實驗證實大腸桿菌K12生長前6h為遲緩期,6~15.5h為對數(shù)增時期,15.5~19.5h為穩(wěn)定期,19.5h后為衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體的復制，然而，松弛型質粒仍可繼續(xù)復制。2、細菌的收獲和裂解

１）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。

第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天２）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。

STE

0.1mol/LNaCl

10mmol/LTris.Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

按步驟１）所述方法離心，以收集細菌細胞。3、堿裂解法

１）將冼過的500ml培養(yǎng)物的細菌沉淀物[來自收獲細菌的步驟3]重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。

溶液Ｉ:

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ｉ可成批配制，在10lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。

第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。

３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ:

0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）

1％SDS

蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。４）加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ:

5mol/L乙酸鉀60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天所配成的溶液對鉀是３mol/L，對乙酸根是5mol/L。

封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內容物，此時應不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質－膜復合物５）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天６）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。７）用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。９）用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）純化。第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天六、質粒DNA的純化

（一）聚乙二醇沉淀法提取質粒ＤＮＡ

１）將核酸溶液所得]轉入15mlＣorex管中，再加3ml用冰預冷的5mol/LLiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于４℃下以10000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。

２）將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉頭（或與其相當?shù)霓D尖）于室溫以10000轉/分離心10分釧，回收沉淀的核酸。

３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

４）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。

第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG8000）的1.6mol/LNaCl,充分混合，用微量離心機于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質粒ＤＮＡ。

６）吸出上清，用400μlTE(pH8.0)溶解質粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。

７）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒ＤＮＡ。

８）吸去上清，加200μl處于4℃以12000g離心2分鐘。

９）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

10）用500μlTE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)]后測量OD260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml），然后將DNA貯于－20℃。第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天七、對重組質粒的檢測與目的基因提取目的基因獲取對獲得的質粒進行雙酶切，獲得目的基因與PBR322質粒片段，通過瓊脂糖凝膠電泳，由于目的基因與PBR322質粒片段相對分子量不同，在電泳過程中產生不同的條帶，通過與已知基因長度的對比，我們可以選出相應的目的基因，接著利用Qiagen純化柱回收純化DNA。具體：用3倍體積的特殊高鹽溶液于55°融化帶有目的基因的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，將DNA釋放到水溶液中。然后將其通過Qiagen純化柱，經過如圖結合—洗滌—洗脫步驟，直接得到純化的DNA樣品。利用核酸探針雜交法鑒定目的基因第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天八、目的基因與表達載體的組合與導入表達載體：PBV220,，將PBV220和目的基因用雙酶切法處理，退火后連接，構建重組質粒，利用CaCl2法導入到宿主大腸桿菌中，構建工程菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用干擾素性質鑒定目的工程菌，分離工程菌，擴大培養(yǎng)，提取出質粒，分析質粒穩(wěn)定性。第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1．菌種制備?。?0℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)18±2小時后，進行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。2．種子罐培養(yǎng)將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級聯(lián)調節(jié)通氣量和攪拌轉速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3～4小時，轉入發(fā)酵罐中，同時取樣發(fā)酵液進行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌

第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3.發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0。級聯(lián)調節(jié)通氣量和攪拌轉速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)5～6.5小時。同時進行發(fā)酵液雜菌檢查，當OD值達9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細胞衰老。或者將發(fā)酵液轉入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集將已降溫的發(fā)酵液轉入連續(xù)流離心機，16000r/min離心收集。進行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質粒結構一致性、質粒穩(wěn)定性等項目的檢測。菌體于－20℃冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天干擾素發(fā)酵過程控制在假單孢桿菌的發(fā)酵生產中，菌體在培養(yǎng)1.5小時分裂速度最快，到3.5小時開始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5小時之后，在4小時達到最大，然后由于降解而迅速下降?？梢娫诎l(fā)酵生產工藝中，假單孢桿菌的生長和干擾素的生產基本處于不相關狀態(tài)，可采用兩段培養(yǎng)的策略進行過程控制。第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天(1)．溶解氧控制分別在生長階段和生產階段采用各自最佳溶解氧濃度，以期提高干擾素的發(fā)酵水平。通過級聯(lián)調節(jié)通氣量和攪拌轉速得以實現(xiàn)。(2).溫度控制假單孢桿菌生長最適溫度與產物形成最適溫度是不同的。產物合成溫度控制在20℃可以有效防止干擾素-α2b的降解，而其最佳生長溫度則為30℃。質粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速下降，因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標產物的降解，增加質粒的穩(wěn)定性。(3)．pH值發(fā)酵過程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。干擾素-α的等電點在pH6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受pH2.5的酸性環(huán)境。因此可在發(fā)酵后期降低pH，從而造成大量蛋白酶失活，減少干擾素-α的水解，提高干擾素的積累量。第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天半成品檢定（1）效價測定

用細胞病變抑制法，以Wish細胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準為國際單位。（2）蛋白質含量測定福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白為標準。（3）比活性效價的國際單位與蛋白質含量的毫克數(shù)之比。（4）純度電泳純度用非還原型SDS法，銀染顯色應為單一區(qū)帶，經掃描儀測定純度應在95%以上。第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天（5）相對分子量測定還原型SDS，加樣量不地域微克，同時用已知相對分子量的蛋白標準系列做對照，以遷移率為橫坐標，相對分子量的對數(shù)為縱坐標作圖，計算相對分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。（6）殘余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應低于100pg。（7）殘余血清IgG含量測定在應用抗體親和層析法作為純化方法時必須進行此項檢定。（8）殘余抗生素活性測定半成品中不應有抗生素活性存在。第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天（9）紫外光譜掃描

檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應在280±2納米。（10）肽圖測定用CNBr裂解法，測定結果應符合干擾素的結構，且批與批之間應一致。（11）等電點測定等電聚焦電泳。（12）除菌半成品應做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質試驗。第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天成品檢定（1）物理性狀凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。（2）鑒別試驗應用ELISA或中和試驗檢定。（3）水分測定用卡氏法，應低于3%。（4）無菌試驗同半成品。第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天（5）熱原質試驗同半成品檢定。

（6）干擾素效價測定同半成品檢定，效價不應低于標示量。（7）安全試驗取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。

取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注射劑量按人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動物全部存活，說明成品合格。第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1.目的基因的獲取為什么用mRNA而不是DNA？基因組，即某種生物一個細胞內全部的DNA信息。將這些DNA打斷，連接到載體上并轉入微生物，使這些微生物細胞內含有某生物的全部基因組。那么這些微生物就組成了基因組文庫。以上兩者包含的都是遺傳信息。對于某種生物來說，任何一個細胞的遺傳信息都是相同的。cD