小反芻獸疫抗體檢測競爭酶聯(lián)免疫吸附法

1小反芻獸疫抗體檢測競爭酶聯(lián)免疫吸附法本標準規(guī)定了檢測小反芻獸疫抗體檢測競爭酶聯(lián)免疫吸附法及其試劑制GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和SN/T2123出入境動物檢疫實驗樣品采集、運而通過底物的顯色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。本標準競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗則是在色反應(yīng)酶標儀讀數(shù)的方式判定待檢血清中是否有小反芻獸2PPRV-N蛋白：小反芻獸疫病毒核蛋白。AcNPV：苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒。SDS：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺）：g)包被液、洗滌液、稀釋液、底物液/顯色劑、終止液：配制方法3單孔道、多孔道可調(diào)微量移液器（1μL、50μL、100μL、1000μL）、2恒溫培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)24h，用Grace'7.2.2取種毒病毒液，用Grace's培養(yǎng)基由10-1開始作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、20%胎牛血清的2xGrace's培養(yǎng)基，置CO2恒溫培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)7d～10d，觀察并進行蝕斑計7.2.4按照病毒滴度=蝕斑數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/每孔體積數(shù)mL進行計算；病毒含量應(yīng)≥1.07.3.1將保存的昆蟲桿狀病毒AcNPV-PPRV-N株種毒，按1∶10比例接種于長成單層的sf9昆7.3.2取生產(chǎn)用種毒按1∶10接種于長成單層的sf9昆蟲細胞，擴大培養(yǎng)，27℃下培養(yǎng)96~4沉淀蛋白，加入硫柳汞至終濃度為0.01%，按0.5μg/mL加入leupeptin（亮PPRV重組N蛋白抗原應(yīng)為白色固體，無臭、無每瓶用PBS復(fù)溶為0.5mL液體。用紫外分光光度計測定在OD280和OD260波長下的光吸收值，按公式1.45×OD280-0.74×OD260計算抗原濃度，蛋白質(zhì)濃度應(yīng)不低于4每瓶PPRV重組N蛋白抗原用去離子水復(fù)溶為0.5mL液體后，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液1∶與5份小反芻獸疫病毒陽性血清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗時，應(yīng)呈陽性反應(yīng)；與小反芻獸58.5.1性狀用紫外分光光度計測定在OD280和OD260波長下的光吸收值，按公式1.45×OD280-0.74×OD260用昆蟲桿狀病毒表達的N蛋白按0.8μg～稀釋度即為其ELISA效價。該效價應(yīng)不低-80℃保存，有效期為12個月。9待測樣品的采集和處理6樣品保存等操作可按《出入境動物檢疫實驗樣品采集、運輸和保存規(guī)范》（SN/T2123用包被液按1∶100稀釋抗原，包被96孔酶標板，每孔100μL，37℃作用1h或4℃包被過取出酶標板棄去液體，每孔加洗液300μL，洗板，共3次。最后每孔加入1∶15000倍稀釋的單克隆抗體50μL，3每孔加入1∶5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG100μL，3每孔加50μL底物液，室溫(20～25℃)避光反應(yīng)17PI=（1-待測血清樣品平均OD450值/陰性孔平均OD450值）×10當PPRV強陽性對照PI值＞80%；50%≤PPRV弱陽性對照PI值≤80%；PPRV陰性對照PI值<8A.1磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol/LpH7.4PBS）A.1.1成分A.1.2制法A.2包被液（0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液）A.2.1成分NaHCO3A.2.2制法A.3洗滌液A.3.1成分NaClNa2HPO49A.3.2制法將各組分充分溶解，加入0.01%硫柳汞，調(diào)節(jié)pH值至7.2，用0.22μm（0.45μm）濾膜過A.4稀釋液：1%明膠或5%雞血清PBST將1g明膠加入洗滌液至100mL，或以雞血清與洗滌液配成5%使用，即為稀A.5