GB-T植物品種鑒定　MNP標(biāo)記法征求意見稿編制說明

一、任務(wù)來源

本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)2017年第二批國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)

劃，項(xiàng)目編號“20171813-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2019

年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由江漢大學(xué)等單位共同組成。

二、目的和意義

（一）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與存在的問題

1、植物品種真實(shí)性鑒定

植物品種鑒定分為田間性狀鑒定與分子鑒定兩種方法，田間性狀鑒定稱為DUS測定,

即特異性、一致性和穩(wěn)定性鑒定。我國《種子法》對依據(jù)田間性狀表現(xiàn)對品種進(jìn)行定義，

因此，田間性狀鑒定具有最終的法律效力。目前，我國田間測試的國家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

已經(jīng)涵蓋191種農(nóng)作物和206種林木。國際上主要的品種鑒定機(jī)構(gòu)包括國際植物新品種保

護(hù)公約組織（UPOV）和國際種子聯(lián)合會(huì)（ISF），他們的制定的田間性狀鑒定標(biāo)準(zhǔn)涵蓋了

近700種植物。

雖然田間鑒定是品種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但田間鑒定需要種植2-3個(gè)生長季節(jié)，周期需要

2-3年甚至更長的時(shí)間。田間鑒定的結(jié)果中包含了環(huán)境的影響，不能夠完全反應(yīng)品種遺傳

的因素。分子鑒定技術(shù)可以克服田間鑒定的不足，具有快速且不受環(huán)境影響的優(yōu)勢，被逐

步用于植物品種鑒定中。

早期的分子標(biāo)記鑒定方法采用蛋白標(biāo)記法，但由于蛋白標(biāo)記可用特征少，已基本被放

棄。后期分子標(biāo)記逐步發(fā)展為DNA分子標(biāo)記。在DNA分子標(biāo)記中，早期有RAPD標(biāo)記法、

ISSR標(biāo)記法、RFLP標(biāo)記法、AFLP標(biāo)記法等。早期的這些DNA標(biāo)記法具有分型不穩(wěn)定、基

因型過多無法分辨、非共顯性等缺陷，基本上都沒有被納入品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過數(shù)十年的

植物品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展與實(shí)踐，只有SSR標(biāo)記法和SNP標(biāo)記法被保留了下來。

SSR標(biāo)記法的主要優(yōu)點(diǎn)在于多態(tài)性高和共顯性。同時(shí)，SSR標(biāo)記法可以在普通的實(shí)驗(yàn)

室通過電泳的方法進(jìn)行檢測，獲得了迅速的推廣?，F(xiàn)有的大部分植物品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)都是基

于SSR標(biāo)記法建立的。然而，聚合酶在擴(kuò)增SSR標(biāo)記中的簡單重復(fù)序列時(shí)，存在“滑動(dòng)”

現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的不存在的錯(cuò)誤基因型；SSR標(biāo)記法依據(jù)片段長度進(jìn)行檢測，但電泳

方式很難精準(zhǔn)判定片段長度，為了進(jìn)行品種間的準(zhǔn)確比較，需要將待測樣品與對照樣品在

同一個(gè)電泳膠上的相鄰泳道上進(jìn)行電汸檢測，稱為平行實(shí)驗(yàn)。很多品種鑒定需要與成千上

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萬的已知品種進(jìn)行比較，比如近似品種的篩選、品種權(quán)侵權(quán)對象的認(rèn)定、實(shí)質(zhì)性派生品種

判定等工作，要求結(jié)果精準(zhǔn)就意味著需要無數(shù)次平行實(shí)驗(yàn)，不具有現(xiàn)實(shí)的可行性。

基于SSR標(biāo)記法存在的問題，SNP標(biāo)記法在近年來被提出且被逐步用于了植物品種鑒

定的標(biāo)準(zhǔn)中，如水稻品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。SNP標(biāo)記法獲得的是具體的堿基序列，因此，不需要

平行實(shí)驗(yàn)，可以同時(shí)比對上千個(gè)品種，改進(jìn)了SSR標(biāo)記法的缺陷。然而，SNP標(biāo)記法也有

自身固有的缺陷。首先，不同于SSR標(biāo)記，SNP標(biāo)記是二態(tài)性標(biāo)記，單個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)區(qū)分力

有限。第二，由于單個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)區(qū)分能力有限，需要檢測大量的SNP標(biāo)記位點(diǎn)才能實(shí)

現(xiàn)品種區(qū)分的目標(biāo)，因而需要高通量的檢測手段，例如基因芯片?；蛐酒a(chǎn)工藝復(fù)雜，

需要一次合成大量的芯片才能降低單位成本，不適合普通實(shí)驗(yàn)室或者小作物等中使用，推

廣應(yīng)用范圍受到了限制。

除SSR標(biāo)記法與SNP標(biāo)記法各自的缺陷外，它們還具有一些共同的不足。第一，準(zhǔn)確

性問題。SSR標(biāo)記法存在7%左右的錯(cuò)誤率，SNP標(biāo)記法的錯(cuò)誤率低于SSR標(biāo)記，為1%左右，

也有報(bào)道為2%甚至在雜交種中，可以達(dá)到6.7%。然而，由于SNP標(biāo)記法檢測位點(diǎn)多，即

使是1%的錯(cuò)誤率，錯(cuò)誤位點(diǎn)數(shù)量也較大，可能嚴(yán)重影響品種鑒定結(jié)論。第二，污染問題。

SSR標(biāo)記法與SNP標(biāo)記法都需要PCR擴(kuò)增富集標(biāo)記位點(diǎn)，由于這兩種方法采用染色或熒光

信號顯示標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因型，因此，需要較多的擴(kuò)增產(chǎn)物和較大的PCR循環(huán)數(shù)，比如

30個(gè)循環(huán)以上。大量的擴(kuò)增產(chǎn)物對實(shí)驗(yàn)室空氣造成污染，稱之為氣溶膠。大量氣溶膠又容

易掉入PCR反應(yīng)中，加之PCR循環(huán)數(shù)多，少量的氣溶膠可能被大量擴(kuò)增，被檢測出來產(chǎn)生

錯(cuò)誤的基因型。由于SSR標(biāo)記法與SNP標(biāo)記法都無法定量檢測，加劇了錯(cuò)誤基因型被檢測

的可能性，加劇了錯(cuò)誤的基因型出現(xiàn)的頻率。第三，操作與實(shí)驗(yàn)室要求問題。為了避免無

處不在的氣溶膠，對實(shí)驗(yàn)室潔凈級別與實(shí)驗(yàn)操作要求都極高，限制了SSR標(biāo)記法與SNP標(biāo)

記法在普通實(shí)驗(yàn)室與普通操作人員中使用。

2實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定

品種B來源于原始品種A且與原始品種A差異不大時(shí)，品種B就成為了原始品種A的

實(shí)質(zhì)性派生品種。簡單地理解，同質(zhì)化嚴(yán)重的品種為實(shí)質(zhì)性派生品種。實(shí)質(zhì)性派生品種制

度要求實(shí)質(zhì)性派生品種及其產(chǎn)品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售與加工過程中與原始品種權(quán)人分享權(quán)

利。因此，實(shí)質(zhì)性派生品種制度的本義是保護(hù)原始創(chuàng)新，限制同質(zhì)化品種。中國目前沒有

實(shí)行實(shí)質(zhì)性派生品種制度，因此，只需要對原始品種稍作改變，即使這種改變沒有任何進(jìn)

步意義，也可以獲得與原始品種權(quán)人相同的權(quán)利。例如，僅通過簡單的回交育種或者誘變

育種的方式，改變了原始品種的穎尖顏色，就可以獲得與原始品種權(quán)人一樣的權(quán)利，“竊

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取”原始品種權(quán)人幾年甚至是幾十年的努力。這是導(dǎo)致中國目前品種同質(zhì)化嚴(yán)重，育種水

平徘徊不前，整體落后于國外發(fā)達(dá)國家的重要原因。世界上已有有70多個(gè)國家或組織實(shí)

行了實(shí)質(zhì)性派生品種制度，中國是僅有的少數(shù)兩三個(gè)沒有正式實(shí)施這一制度的國家?？上?/p>

的是，中國已經(jīng)投入實(shí)際行動(dòng)，準(zhǔn)備試行這一制度。

實(shí)行實(shí)質(zhì)性派生品種制度的前提是要有實(shí)質(zhì)性派生品種判定的方法與標(biāo)準(zhǔn)，但中國目

前實(shí)質(zhì)性派生品種判定的方法與標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重阻礙了這一重大農(nóng)業(yè)制度的實(shí)施與安排。

（三）項(xiàng)目的意義

為了充分解決現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中所采用的SSR標(biāo)記法和SNP標(biāo)記法所存在的問題，以及解決

中國缺乏實(shí)質(zhì)性派生品種制度實(shí)施所必須的實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定方法與標(biāo)準(zhǔn)的問題，本標(biāo)

準(zhǔn)綜合了分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)的知識(shí)與原理，發(fā)明了MNP標(biāo)記法，用于品種

真實(shí)性鑒定與實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定。MNP標(biāo)記法具有以下優(yōu)勢：（1）等位基因型豐富。MNP

標(biāo)記有多至2n種等位基因型（其中，n為MNP標(biāo)記中的SNP標(biāo)記的數(shù)量），遠(yuǎn)大于SNP標(biāo)

記的種等位基因型，具有SSR標(biāo)記等位基因型數(shù)量豐富的特點(diǎn)，品種區(qū)分能力強(qiáng)。

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（2）2避=免2了SSR標(biāo)記的局限。MNP標(biāo)記中沒有SSR標(biāo)記的簡單重復(fù)序列，避免了PCR擴(kuò)增

時(shí)產(chǎn)生的“滑脫”錯(cuò)誤；MNP標(biāo)記法獲得的是堿基序列，十分標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)條件下的結(jié)

果間可以自由且準(zhǔn)確的比對。（3）避免了SNP標(biāo)記的局限。在混合DNA分型中，MNP標(biāo)記

出錯(cuò)的概率為各個(gè)SNP標(biāo)記同時(shí)出錯(cuò)的概率，錯(cuò)誤率低且靈敏度高。MNP標(biāo)記等位基因型

豐富，品種區(qū)分能力強(qiáng)，品種鑒定時(shí)需要的MNP標(biāo)記數(shù)量少，減少了出錯(cuò)標(biāo)記的數(shù)量，可

以采用成本較高的測序技術(shù)進(jìn)行檢測，避免了SNP芯片雜交背景引起技術(shù)誤差。（4）可

以定量。同一個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)利用二代高通量測序技術(shù)重復(fù)抽樣檢測了數(shù)百個(gè)測序片段，

可以定量等位基因型比例、轉(zhuǎn)基因含量、多倍體基因劑量等。（5）效率高。一次PCR反

應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增了數(shù)百個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)；一次高通量測序可同時(shí)檢測數(shù)百個(gè)樣本的數(shù)千個(gè)MNP

標(biāo)記，效率極高。例如，我們2個(gè)人10天內(nèi)檢測了600份早稻DNA樣本的700個(gè)標(biāo)記位

點(diǎn)。（6）品種真實(shí)性鑒定中的核心引物、擴(kuò)展引物和實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定方法合為一體。

UPOV和ISF等組織利用遺傳相似度判定實(shí)質(zhì)性派生品種，其核心是要求檢測的標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)

量足夠且多態(tài)性高，才能準(zhǔn)確計(jì)算遺傳相似度。MNP標(biāo)記法具有多態(tài)性高的特點(diǎn)，同時(shí)，

MNP標(biāo)記法檢測效率高，本標(biāo)準(zhǔn)中為每一個(gè)作物規(guī)定了500個(gè)以上的標(biāo)記位點(diǎn)。因此，本

標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的品種真實(shí)性鑒定方法與實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定方法合二為一，統(tǒng)一了標(biāo)準(zhǔn)，同

時(shí)為我國實(shí)質(zhì)性派生品種制度的實(shí)施奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

基于以上技術(shù)特點(diǎn)，MNP標(biāo)記法具有準(zhǔn)確、高效、通用等特點(diǎn)，可以用于植物品種權(quán)

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精準(zhǔn)授權(quán)、打假與維權(quán)，為《種子法》的實(shí)施提供了可靠的標(biāo)準(zhǔn)手段。將品種真實(shí)性鑒定

與實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定合二為一，有助于規(guī)范了種業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)、市場秩序、提升中國種業(yè)

育種水平和國際競爭力。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

1、高度可重現(xiàn)性

利用標(biāo)準(zhǔn)中的方法獲得的結(jié)果高度可重現(xiàn)，確保不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可以進(jìn)行精準(zhǔn)比

較。

2、高效性

一個(gè)人利用標(biāo)準(zhǔn)中的方法在一周內(nèi)，可以鑒定數(shù)百個(gè)品種，每個(gè)品種鑒定數(shù)千個(gè)位點(diǎn)。

3、通用性

在品種真實(shí)性鑒定與實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定中通用。

將品種真實(shí)性鑒定的核心引物與擴(kuò)展引物合二為一。

在多種植物中通用，包括自花授粉植物、異花授權(quán)植物、常異花授粉植物、二倍體植

物、多倍體植物、農(nóng)作物、園藝植物、果樹、中藥等。

（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)

1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

的有關(guān)要求。

2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考我國相關(guān)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)，包括《種子法》，以及水稻、玉米、

小麥、馬鈴薯等農(nóng)作物品種的SSR標(biāo)記與SNP標(biāo)記鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)。

四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

（一）MNP標(biāo)記篩選

在標(biāo)記篩選中，遵守?cái)U(kuò)增區(qū)多態(tài)性高、引物區(qū)保守、擴(kuò)增區(qū)盡量選擇單拷貝區(qū)域、在

不同品種中的缺失率低等引物篩選的通用原則；引物在參考基因組上的擴(kuò)增長度不超過

250bp等其它特殊要求。

（二）樣品類型

在正常體細(xì)胞組織中，父母本等位基因型拷貝數(shù)多為1:1，因此，均容易被檢出。在

種子胚乳中，父母本等位基因型拷貝數(shù)多為2:1，因此，母本等位基因型容易在檢測中丟

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失。為了避免這一問題，樣品類型宜選用葉、根、莖、胚等以體細(xì)胞倍性為主的幼嫩且新

鮮的樣本，也可以選用種子。但種子中由于等位基因型拷貝數(shù)不均衡，更可能出現(xiàn)等位基

因型丟失。幼嫩且新鮮的組織提取的DNA量大且不容易降解，因此應(yīng)該優(yōu)先考慮。

（三）樣品純度

已有的國家標(biāo)準(zhǔn)中，本標(biāo)準(zhǔn)適用范圍中的所有作物的種子純度都不低于95%，本標(biāo)準(zhǔn)

的要求與國家標(biāo)準(zhǔn)對大田用種的純度要求保持一致，以避免雜種子對分型結(jié)果的影響。

（四）實(shí)驗(yàn)操作

本標(biāo)準(zhǔn)中多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)在20個(gè)以下，處于線性增長期。采用二代高通量測序?qū)U(kuò)

增的線性產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可以實(shí)現(xiàn)等位基因型間的相對定量。利用定量結(jié)果，可以排除實(shí)

驗(yàn)室的氣溶膠污染。因此，本標(biāo)準(zhǔn)對防止氣溶膠的污染要求并不是十分嚴(yán)格，只要求實(shí)驗(yàn)

分區(qū)、單向流動(dòng)、設(shè)備器具專用且保持通風(fēng)，這些要求在普通實(shí)驗(yàn)室可以滿足，降低了本

標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施條件的要求，使得本標(biāo)準(zhǔn)可以在更多實(shí)驗(yàn)室更方便地實(shí)施。

（五）多重PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)

根據(jù)的我們的大量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，PCR循環(huán)數(shù)≦20個(gè)時(shí)，等位基因型的比例在重現(xiàn)性實(shí)

驗(yàn)中保持穩(wěn)定，避免了由于等位基因型消失造成的實(shí)驗(yàn)不可重現(xiàn)性，因此，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定多

重PCR循環(huán)數(shù)≦20個(gè)。

（六）測序量與質(zhì)量控制

我們利用本標(biāo)準(zhǔn)的方法，從2016年到2019年鑒定檢測了1萬多個(gè)植物品種樣本。當(dāng)

將平均測序量設(shè)置為700倍以上時(shí)，95%以上的樣品的平均覆蓋倍數(shù)都可以達(dá)到規(guī)定的500

倍。當(dāng)平均覆蓋倍數(shù)達(dá)到500倍及以上時(shí)，99%以上的樣品在一次實(shí)驗(yàn)中，或的值可

以達(dá)到95%及以上，以保證在以上參數(shù)的規(guī)定下，絕大部分品種鑒定實(shí)驗(yàn)可R以1一R次2性地通

過測序數(shù)據(jù)量質(zhì)量控制。圖一到圖八列了幾種具體物種在幾千個(gè)品種的檢測中，測序片段

數(shù)與（縱坐標(biāo)）之間的關(guān)系。

R1

5

圖一、龍眼的測序片段數(shù)量和標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

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圖二、蕃茄的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

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圖三、棉花的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

8

圖四、荔枝的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

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圖五、玉米的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

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圖六、水稻的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

圖七、黃瓜的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

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圖八、谷子的測序片段數(shù)量和與標(biāo)記位點(diǎn)的檢出率。（注：橫坐標(biāo)為品種）

對于水稻、玉米、棉花等作物來說，其基因組的大部分變異信息是已知的，因此，實(shí)

驗(yàn)大多可以一次達(dá)到不低于95%的位點(diǎn)檢出，其部分實(shí)例見圖一至圖八。不論是SSR標(biāo)記

法、SNP標(biāo)記法還是MNP標(biāo)記法，都依賴于PCR擴(kuò)增，因些，可能存在一些品種因?yàn)閬碓?/p>

特殊，基因組DNA的序列變異較多，導(dǎo)致較多的擴(kuò)增引物與基因組不匹配，不能擴(kuò)增，因

此，不能簡單地規(guī)定必須每個(gè)品種檢測出位點(diǎn)都要不低于95%以上，那樣從原理上就會(huì)導(dǎo)

致一定有某些特殊的品種無法應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)。

之所以希望檢出位點(diǎn)的比例不低于95%以上，是為了防止在不同的實(shí)驗(yàn)中，檢出位點(diǎn)

變異較大，從而導(dǎo)致遺傳相似系數(shù)計(jì)數(shù)在不同實(shí)驗(yàn)中相差較大，最終導(dǎo)致品種鑒定結(jié)論由

于位點(diǎn)抽樣的原因?qū)е缕钶^大。為了防止這一問題，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了樣品測序數(shù)據(jù)對樣品

的標(biāo)記位點(diǎn)的平均測序覆蓋倍數(shù)不低于500倍，此時(shí)，測序的抽樣誤差已經(jīng)很少，PCR擴(kuò)

增成功的位點(diǎn)基本被檢出，可以保證不同實(shí)驗(yàn)的檢出的標(biāo)記位點(diǎn)基本沒有抽樣誤差，但為

了更加保險(xiǎn)，本標(biāo)準(zhǔn)對于檢出的標(biāo)記位點(diǎn)低于95%的樣品，要求從DNA提取開始重新實(shí)驗(yàn)，

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以模擬不同的實(shí)驗(yàn)，要求在兩次不同的實(shí)驗(yàn)中，共同檢出的標(biāo)記位點(diǎn)的比例不低于95%，

從結(jié)果上進(jìn)一步保證了不同實(shí)驗(yàn)間的檢出的標(biāo)記位點(diǎn)的抽樣偏差控制在5%以內(nèi)，保證了不

同品種鑒定實(shí)驗(yàn)的結(jié)論的一致性。

（七）本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的MNP標(biāo)記法的準(zhǔn)確性

本標(biāo)準(zhǔn)以及其它標(biāo)準(zhǔn)都是以遺傳相似系數(shù)作為品種鑒定的依據(jù)。因此，計(jì)算遺傳相似

系數(shù)的準(zhǔn)確率，決定了品種鑒定的準(zhǔn)確率。而遺傳相似系數(shù)的計(jì)算又是根據(jù)品種間具有差

異和相同基因型的標(biāo)記位點(diǎn)的數(shù)目進(jìn)行計(jì)算的。因此，品種鑒定的準(zhǔn)確性最終取決于品種

的基因型分型的準(zhǔn)確性。

由于真實(shí)值是未知的，因此，任何方法的絕對準(zhǔn)確率是不可計(jì)算的。在實(shí)踐中，要么

將參考值假定為真實(shí)值計(jì)算準(zhǔn)確率，要么利用精確度估計(jì)準(zhǔn)確率。由于品種的標(biāo)記位點(diǎn)的

基因的參考值也是未知的，因此，我們利用三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)或者重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)來計(jì)算精確度，

進(jìn)而計(jì)算分型的準(zhǔn)確率，準(zhǔn)確率=1-（1-精確度）/2。其中，精確度是指兩次實(shí)驗(yàn)的分型

結(jié)果一致的標(biāo)記位點(diǎn)占所有標(biāo)記位點(diǎn)的比例，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)指由相同的人在相同的地點(diǎn)使用

相同的試劑和儀器設(shè)備在短的間隔時(shí)間內(nèi)做的兩次實(shí)驗(yàn)，重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)指在3天以上的時(shí)間

間隔條件下所做的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)?zāi)M了不同批次的鑒定，重現(xiàn)率高意味著不

同實(shí)驗(yàn)室的鑒定結(jié)果可以相互進(jìn)行準(zhǔn)確的比較。

從表一可以看出，利用至少150,284個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)分型結(jié)果的統(tǒng)計(jì)表明，不論是重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)，還是重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，不論是簡單的二倍體物種水稻中，還是復(fù)雜的多倍體物種棉花中，

MNP標(biāo)記法分型的結(jié)果的準(zhǔn)確率都在99.98%以上。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定鑒定MNP標(biāo)記位點(diǎn)不超過

1100個(gè)（表二），那么，在一次鑒定中，錯(cuò)誤的位點(diǎn)數(shù)量不超過1100*（1-99.98%）=0.41

個(gè)，其對遺傳相似系數(shù)的計(jì)算的變異不超過0.0375%，對非平行實(shí)驗(yàn)即不同實(shí)驗(yàn)室的品種

鑒定結(jié)果間比較的準(zhǔn)確性的影響是很小的，基本可以忽略。

由于本標(biāo)準(zhǔn)中的方法在重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中的準(zhǔn)確性超過99.98%，因此，可以在不同實(shí)驗(yàn)室

不同時(shí)間中做出來的結(jié)果直接進(jìn)行準(zhǔn)確的比對，而不必在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室做平行實(shí)驗(yàn)，也不

需要實(shí)驗(yàn)重復(fù)，對于品種鑒定提供了極大的方便。同時(shí)，可以將獲得的等位基因型與DNA

身份證數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行大量的比較，同樣可以獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，因此，極大地方

13

便了近似品種的準(zhǔn)確篩選、品種權(quán)侵權(quán)對象的準(zhǔn)確確定、以及實(shí)質(zhì)性派生品種的準(zhǔn)確鑒定

等應(yīng)用。這些應(yīng)用需要將一個(gè)品種的分型結(jié)果與成千上萬個(gè)品種的分型結(jié)果進(jìn)行比對，通

過平行實(shí)驗(yàn)就需要做成千上萬次實(shí)驗(yàn)，不具有可行性，通過本標(biāo)準(zhǔn)的方法，只需要一次實(shí)

驗(yàn)，然后把比對工作交給計(jì)算機(jī)處理即可，使得近似品種的準(zhǔn)確篩選、品種權(quán)侵權(quán)對象的

準(zhǔn)確鑒定、以及實(shí)質(zhì)性派生品種的準(zhǔn)確鑒定等應(yīng)用成為了可能。

表一水稻與棉花標(biāo)記位點(diǎn)分型結(jié)果的重現(xiàn)性

比較的標(biāo)基因型不同的標(biāo)記

物實(shí)驗(yàn)類別分型的精分型的準(zhǔn)

記位點(diǎn)的位點(diǎn)

種確率確率

建庫測序數(shù)目數(shù)目比例

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)306,651100.0033%99.997%99.998%

水

相同文庫重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)155,231100.0064%99.994%99.997%

稻

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)306,528350.0114%99.989%99.994%

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)295,975680.0230%99.977%99.989%

棉

相同文庫重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)150,284540.0359%99.964%99.982%

花

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)295,9571110.0375%99.962%99.981%

（八）本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的MNP標(biāo)記法的品種鑒定能力

品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)的核心任務(wù)是利用檢測的標(biāo)記位點(diǎn)對待測品種和對照品種進(jìn)行區(qū)分。有

兩個(gè)重要因素影響了品種鑒定的核心任務(wù)，第一，單個(gè)標(biāo)記的區(qū)分能力越強(qiáng)，該標(biāo)記法區(qū)

分品種的能力就越強(qiáng)；第二，使用的標(biāo)記數(shù)目越多，該標(biāo)記法的品種區(qū)分能力就越強(qiáng)。

我們利用1500個(gè)水稻品種，比較了約300個(gè)隨機(jī)選擇的SSR標(biāo)記和約300個(gè)隨機(jī)選

擇的MNP標(biāo)記的等位基因型數(shù)量，其結(jié)果見圖九。從圖九可以看出，在1500個(gè)水稻品種

中，SSR標(biāo)記的等位基因型數(shù)量的平均值為5.5個(gè)，MNP標(biāo)記的等位基因型的平均值為6.6

個(gè)，MNP標(biāo)記的等位基因型的數(shù)量比SSR標(biāo)記高了1.1個(gè)，比例達(dá)到18.18%。在已有的分

子標(biāo)記類型中，SSR標(biāo)記的多態(tài)性是最高的，顯示了單個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)具有極強(qiáng)的品種區(qū)

分能力，同時(shí)也表明，MNP標(biāo)記法的品種區(qū)分能力可以與SSR標(biāo)記法的品種區(qū)分能力進(jìn)行

類比，因此，下面對于MNP標(biāo)記法的標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量的分析也是依據(jù)與SSR標(biāo)記法進(jìn)行類比

而進(jìn)行說明的。

14

圖九，1500個(gè)水稻品種中，平均等位基因型數(shù)量

圖九從理論上證明了MNP標(biāo)記具有極高的多態(tài)性，因此，從理論上講MNP標(biāo)記具有很

強(qiáng)的品種區(qū)分能力。那么，實(shí)踐中，MNP標(biāo)記是否真的具有很強(qiáng)的品種區(qū)分能力呢？我們

利用MNP標(biāo)記法鑒定了多種物種的大量品種的DNA身份證，將每對品種間差異的MNP標(biāo)記

的比例稱為品種間距離，品種間距離直接顯示了MNP標(biāo)記對品種的區(qū)分能力。圖十至圖十

八顯示利用MNP標(biāo)記法鑒定的4000多萬對品種間的比較結(jié)果，結(jié)果顯示，MNP標(biāo)記在不同

作物的不同品種間具有很好的多態(tài)性。

圖十，7,503對龍眼品種間距離分布

15

圖十一17,956對番茄品種間距離分布

16

圖十二29,883對棉花品種間距離分布

圖十三，2,557對荔枝樣品間距離分布

17

圖十四，621,056對玉米品種間距離分布

18

圖十五，3,730,438對水稻品種間距離分布

19

圖十六，5，672對艾草樣品的距離分布

圖十七，7，503對黃瓜樣品間距離分布

20

圖十八，3，733對黃瓜樣品間距離分布

表二列出了本標(biāo)準(zhǔn)范圍中的16種植物的標(biāo)記數(shù)目。從表二可以看出，本標(biāo)準(zhǔn)使用的

標(biāo)記數(shù)目最少也有500個(gè)，最多的有1042個(gè)，而現(xiàn)有的基于SSR標(biāo)記法的標(biāo)準(zhǔn)中，最多

的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)目也不超過50個(gè)（見表三），從標(biāo)記位點(diǎn)的數(shù)目上保障了本標(biāo)準(zhǔn)對品種區(qū)分能

力的提高了12.03到23.38倍。值得一提的是，實(shí)質(zhì)性派生品種的鑒定需要計(jì)算遺傳相似

系數(shù)，因此，使用的標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)目要足夠才能準(zhǔn)確計(jì)算遺傳相似系數(shù)。已有的SSR標(biāo)記法

使用不超過50個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)（見表三），因此，無法用于遺傳相似系數(shù)和實(shí)質(zhì)性派生品種

的精準(zhǔn)鑒定。UPOV用于實(shí)質(zhì)性派生品種判定的SSR標(biāo)記數(shù)量不超過400個(gè)，因此，本標(biāo)準(zhǔn)

中使用的標(biāo)記數(shù)量對于實(shí)質(zhì)性派生品種的判定也是足夠的。

表二、MNP標(biāo)記法與SSR標(biāo)記法使用的標(biāo)記位點(diǎn)的數(shù)量

物種MNP標(biāo)記法SSR標(biāo)記法MNP標(biāo)記法/SSR標(biāo)記法

水稻10334821.521

玉米9354023.375

大豆5073614.083

蕃茄5794812.063

棉花10423926.718

西瓜7302826.071

辣椒8322237.818

黃瓜5323515.200

大白菜5153017.167

龍眼650//

荔枝600//

甜瓜734//

辣椒832//

艾草317//

21

獼猴桃500//

谷子800//

從以上分析可以看出，本標(biāo)準(zhǔn)中使用的MNP標(biāo)記法不僅單個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)對品種的區(qū)分能

力強(qiáng)，可以達(dá)到目前已知的品種區(qū)分能力最強(qiáng)的SSR標(biāo)記的對品種的區(qū)分能力，而且標(biāo)準(zhǔn)

中使用的標(biāo)記數(shù)量也遠(yuǎn)大于SSR標(biāo)記法的10倍以上。二者共同決定了MNP標(biāo)記法具有極

強(qiáng)的品種區(qū)分能力，再加上分型的高率準(zhǔn)確性（表一），MNP標(biāo)記法可以出色地完成植物

品種鑒定任務(wù)。

（九）品種鑒定的遺傳相似度判定閾值

1、實(shí)質(zhì)性派生品種的判定閾值

實(shí)質(zhì)性派生品種和原始品種的目的是鼓勵(lì)原始創(chuàng)新，判定閾值嚴(yán)格創(chuàng)新性越高但現(xiàn)有

體系沖擊更大，判定的閾值寬松雖然可以保持穩(wěn)定但又不利于創(chuàng)新。因此，判定閾值需要

根據(jù)特定植物種類的育種水平、標(biāo)記方法等因素進(jìn)行綜合平衡制定，需要在應(yīng)用中社會(huì)廣

泛討論后才能形成共識(shí)，因此，在本標(biāo)準(zhǔn)中，不宜直接規(guī)定該判定閾值的具體大小，等待

未來在公眾形成共識(shí)后再確定具體值。

2、品種真實(shí)性的判定閾值

《種子法》依據(jù)性狀對新品種進(jìn)行定義，即與已知品種間至少有一個(gè)性狀的差異稱為

新品種。由于分子標(biāo)記的差異與性狀的差異之間的關(guān)系不是一一對應(yīng)的關(guān)系，只能在一定

概率保障下具有對應(yīng)關(guān)系，即當(dāng)分子標(biāo)記差異較大時(shí)，高概率地保證至少有一個(gè)性狀的差

異，從而判定其為不同的品種。當(dāng)分子標(biāo)記差異較小時(shí)，有一定的概率保障為相同品種。

然而，即使是差異為0個(gè)標(biāo)記，也不能絕對保障兩個(gè)品種間沒有性狀差異，因?yàn)榉肿訕?biāo)記

是基因組上標(biāo)記位點(diǎn)的抽樣，可能還存在沒有抽到的差異標(biāo)記位點(diǎn)。事實(shí)上，即使從哲學(xué)

的角度看，不存在絕對相同的兩個(gè)品種，性狀鑒定也不能保證鑒定完所有的性狀。

基于以上理由，分子標(biāo)記的判定閾值實(shí)際上就是一定概率保障的閾值，不是絕對意義

上的相同品種與不同品種的劃分界線，事實(shí)上，并沒有一條可以完全區(qū)分相同與不同品種

的閾值界線，因?yàn)槎叩姆植际遣糠种丿B的。

因此，遺傳相似度的閾值劃分是具有一定的主觀性的，除了與性狀的關(guān)聯(lián)因素考慮外，

還需要考慮多種因素進(jìn)行綜合平衡，再取一個(gè)相對能夠接受的值。當(dāng)植物在生產(chǎn)中廣泛使

22

用且選育周期不太長時(shí)，選育的品種的目的多樣化且育成品種的數(shù)目比較多，品種特性需

求也比較細(xì)致，不同品種之間的區(qū)分可能比較細(xì)微，因此，判定不同品種的閾值宜低，此

類植物主要包括大田和蔬菜作物。但作物不重要時(shí)或者選育周期很長時(shí)，育成品種數(shù)目不

多，品種間區(qū)分度就比較大，可以適當(dāng)?shù)靥岣吲卸ú煌贩N的閾值，此類作物主要為林木

和中藥材。表一列出了16個(gè)現(xiàn)行品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)中，判定近似品種的閾值。其中，蘋果為

果樹，育種周期長，判定的閾值為8.57%，較高。值得說明的是，我們同時(shí)采用SSR標(biāo)記

法和MNP標(biāo)記法檢測了1500個(gè)水稻品種，SSR標(biāo)記與MNP標(biāo)記的多態(tài)性大致相當(dāng)，因此，

SSR標(biāo)記法的閾值可以作為MNP標(biāo)記法閾值的參考值。但在參考SSR標(biāo)記法的閾值時(shí)，應(yīng)

充分注意表一所有標(biāo)準(zhǔn)采用的SSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)目不足50個(gè)，因此，差異一個(gè)位點(diǎn)就變化

2%以上的差異比例，抽樣誤差較大，因此，表一中的閾值標(biāo)準(zhǔn)是考慮較多的技術(shù)誤差或者

位點(diǎn)的抽樣誤差的結(jié)果，而MNP標(biāo)記法分型十分準(zhǔn)確（表一），標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量也很多（表

二），這兩類誤差都已經(jīng)充分避免，因此，表一中的閾值只能作為本標(biāo)準(zhǔn)閾值制定的參考

值。

表三，現(xiàn)行品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)中，判定近似品種的閾值

判“近似品種”的差

序

物種標(biāo)準(zhǔn)號標(biāo)記法檢測位點(diǎn)數(shù)異位點(diǎn)的閾值

號

位點(diǎn)比例

1水稻NY/T1433-2014SSR標(biāo)記法4824.17%

2水稻NY/T3475-2015SNP標(biāo)記法30721545%

3玉米NY/T1432-2014SSR標(biāo)記法4025.00%

4大豆NY/T2595-2014SSR標(biāo)記法3612.78%

5蕃茄NY/T2471-2013Indel標(biāo)記法4812.08%

6棉花NY/T2063-2014SSR標(biāo)記法3925.13%

7西瓜NY/T2472-2013SSR標(biāo)記法2827.14%

8辣椒NY/T2047-2013SSR標(biāo)記法2229.09%

9黃瓜NY/T2474-2013SSR標(biāo)記法3512.86%

10大白菜NY/T2476-2013SSR標(biāo)記法3026.67%

11小麥NY/T2470-2013SSR標(biāo)記法2129.52%

12高粱NY/T2467-2013SSR標(biāo)記法4012.50%

13甘藍(lán)型油菜NY/T2468-2013SSR標(biāo)記法4748.51%

14結(jié)球甘藍(lán)NY/T2473-2013SSR標(biāo)記法2015.00%

15陸地棉NY/T2469-2013SSR標(biāo)記法3937.69%

16蘋果NY/T2478-2013SSR標(biāo)記法3538.57%

23

在多個(gè)文獻(xiàn)中，SNP標(biāo)記都有1%以上的不可重現(xiàn)性，在雜交種中，可達(dá)到3%的不可重

現(xiàn)性，而SSR標(biāo)記的重現(xiàn)性更低。我們在不同實(shí)驗(yàn)室由不同人采用不同的試劑和儀器按本

標(biāo)準(zhǔn)的方法，驗(yàn)證了大量標(biāo)記位點(diǎn)的分型數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，分型重現(xiàn)性均大于99.98%（表一）。

綜合考慮植物特點(diǎn)和技術(shù)誤差，本標(biāo)準(zhǔn)將區(qū)分水稻、玉米、大豆、棉花、花生、谷子、

西瓜、甜瓜、黃瓜、番茄