基因工程技術(shù)

關(guān)于基因工程技術(shù)

一概述

基因工程技術(shù)使很多自然界很難或不能獲得的蛋白得以大規(guī)模合成.80年代以來,表達(dá)真核cDNA,細(xì)菌毒素和病毒抗原基因等,為人類獲取大量醫(yī)用價(jià)值的多肽蛋白開辟了新途徑.

基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn):生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽,胰島素,干擾素等,細(xì)胞因子等;

可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì);發(fā)現(xiàn)更多內(nèi)源生理活性物質(zhì);定向改變內(nèi)源生理活性物質(zhì);獲得新化合物,擴(kuò)大藥物來源.第2頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

重組DNA技術(shù)也稱為分子克隆技術(shù)。供體、受體、載體是其三大基本元件。

基因工程:利用重組技術(shù)，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對各種生物的核酸（基因）進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入微生物或真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的基因產(chǎn)物，或者改造、創(chuàng)造新的生物類型。是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用.

包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；

下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。第3頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

從實(shí)質(zhì)上講，基因工程的定義強(qiáng)調(diào)了外源DNA分子的新組合被引入到一種新的寄主生物中進(jìn)行繁殖。這種DNA分子的新組合是按工程學(xué)的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和操作的，這就賦予基因工程跨越天然物種屏障的能力，克服了固有的生物種間限制，擴(kuò)大和帶來了定向創(chuàng)造生物的可能性，這是基因工程的最大特點(diǎn)。

基因工程要素：包括外源DNA，載體分子，工具酶和受體細(xì)胞等。第4頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

一個(gè)完整的、用于生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：（1）外源目標(biāo)基因的分離、克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。此工作是整個(gè)基因工程的基礎(chǔ)，又稱為基因工程的上游部分；（2）適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組；（3）外源基因的導(dǎo)入；（4）外源基因在宿主基因組上的整合、表達(dá)及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選；（5）外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生理功能的核實(shí)；（6）轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立，以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析；（7）生態(tài)與進(jìn)化安全保障機(jī)制的建立；（8）消費(fèi)安全評價(jià)。第5頁,共172頁，2024年2月25日，星期天二基因工程誕生的理論依據(jù)（1）DNA是遺傳物質(zhì)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。地球上的一切生物，它們的基因都是一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)都是一樣的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原則上是可以重組互換的。（2）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。（3）中心法則和遺傳密碼遺傳密碼是通用的。一系列三聯(lián)密碼子（除極少數(shù)的幾個(gè)以外）同氨基酸之間的對應(yīng)關(guān)系，在所有生物中都是相同的?，F(xiàn)在，基因是可以人工會成的。第6頁,共172頁，2024年2月25日，星期天（4）基因是可切割的基因直線排列在DNA分子上。作為DNA分子上一個(gè)特定核苷酸序列的基因，允許一個(gè)一個(gè)完整地被切割下來。（5）基因是可以轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)有的基因可以在染色體DNA上移動，甚至可以在不同染色體間進(jìn)行跳躍，插入到靶DNA分子之中。（6）多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系普遍認(rèn)為，一種多肽就有一種相對應(yīng)的基因。因此，基因的轉(zhuǎn)移或重組可以根據(jù)其表達(dá)產(chǎn)物多肽的性質(zhì)來檢查。（7）基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞經(jīng)重組的基因一般來說是能傳代的，可以獲得相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因生物。第7頁,共172頁，2024年2月25日，星期天基因工程的研究內(nèi)容

1、基礎(chǔ)研究基因工程問世以來，科技工作者始終十分重視基礎(chǔ)研究，包括構(gòu)建一系列克隆載體和相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)，建立不同物種的基因組文庫和cDNA文庫，開發(fā)新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了豐碩的研究成果，使基因工程技術(shù)不斷趨向成熟。第8頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

(1)、基因工程克隆載體的研究基因工程的發(fā)展是與克隆載體構(gòu)建密切相關(guān)的，由于最早構(gòu)建和發(fā)展了用于原核生物的克隆載體，所以以原核生物為對象的基因工程研究首先得以迅速發(fā)展。

Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)以及成功地構(gòu)建了Ti質(zhì)粒衍生的克隆載體后，植物基因工程研究隨之就迅速發(fā)展起來。動物病毒克隆載體的構(gòu)建成功，使動物基因工程研究也有一定的進(jìn)展?？梢哉J(rèn)為構(gòu)建克隆載體是基因工程技術(shù)路線中的核心環(huán)節(jié)。至今已構(gòu)建了數(shù)以千計(jì)的克隆載體。但是構(gòu)建新的克隆載體仍是今后研究的重要內(nèi)容之一。尤其是適合用于高等動植物轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體和定位整合載體還須大力發(fā)展。第9頁,共172頁，2024年2月25日，星期天(2)基因工程受體系統(tǒng)的研究基因工程的受體與載體是一個(gè)系統(tǒng)的兩個(gè)方面。前者是克隆載體的宿主，是外源目的基因表達(dá)的場所。受體可以是單個(gè)細(xì)胞，也可以是組織、器官、甚至是個(gè)體。用作基因工程的受體可分為兩類，即原核生物和真核生物。

原核生物大腸桿菌是早期被采用的最好受體系統(tǒng)，應(yīng)用技術(shù)成熟，幾乎是現(xiàn)有一切克隆載體的宿主；

酵母菌是較早被用作基因工程受體的真核生物。有人把酵母菌同大腸桿菌一起看作是第一代基因工程受體系統(tǒng)。

高等植物也已用作基因工程的受體，一般用其愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體，也用部分組織和器官。第10頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

高等植物也已用作基因工程的受體，一般用其愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體，也用部分組織和器官。目前用作基因工程受體的植物有雙子葉植物擬南芥、煙草、番茄、棉花等，單子葉植物水稻、玉米、小麥等，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物。動物鑒于體細(xì)胞再分化能力差，目前主要以生殖細(xì)胞或胚細(xì)胞作為基因工程受體，獲得了轉(zhuǎn)基因鼠、魚、雞等動物。

第11頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

(3)目的基因研究

基因是一種有限的戰(zhàn)略性資源。因此開發(fā)基因資源已成為發(fā)達(dá)國家之間激烈競爭的焦點(diǎn)之一，誰擁有基因?qū)＠?，誰就在基因工程領(lǐng)域占主導(dǎo)地位?；蚬こ叹褪情_發(fā)人們特殊需要的基因產(chǎn)物，這樣的基因統(tǒng)稱為目的基因。具有優(yōu)良性狀的基因理所當(dāng)然是目的基因。而致病基因在特定情況下也具有很大的開發(fā)價(jià)值。即使那些尚不清楚功能的基因，隨著研究的深入，也許以后成為具有很大開發(fā)價(jià)值的目的基因。

第12頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

獲得目的基因的途徑很多，主要是通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫，從中篩選出特殊需要的基因。近年來也廣泛使用PCR技術(shù)直接從某生物基因組中擴(kuò)增出需要的基因。對于較小的目的基因也可用人工化學(xué)合成。現(xiàn)在已獲得的目的基因大致可分為三大類：第一類是與醫(yī)藥相關(guān)的基因；第二類是抗病、蟲害和惡劣生境的基因；第三類是編碼具特殊營養(yǎng)價(jià)值的蛋白或多肽的基因。第13頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

(4)基因工程工具酶的研究基因工程工具酶指體外進(jìn)行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、修飾酶和連接酶等。限制性核酸內(nèi)切酶用于有規(guī)律地切割DNA把提供的DNA原材料切割成具特定末端的DNA片段。現(xiàn)已從不同生物中發(fā)現(xiàn)和分離出上千種限制性核酸內(nèi)切酶，基本上可滿足按不同目的切割各種DNA分子的需要。耐熱性限制性核酸內(nèi)切酶和長識別序列稀切酶仍是當(dāng)前研究的熱門課題。

第14頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

DNA連接酶用于連接各種DNA片段，使不同基因重組?，F(xiàn)在常用的DNA連接酶只有兩種，即大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶。

DNA聚合酶用于人工合成連桿、引物等DNA小片段以及含基因的較大的DNA片段，還用于制備DNA探針。多種耐熱性DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，使使PCR技術(shù)迅速發(fā)展．給當(dāng)今生命科學(xué)提供了先進(jìn)的研究手段。第15頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

(5)基因工程新技術(shù)研究圍繞外源基因?qū)耸荏w細(xì)胞，發(fā)展了一系列用于不同類型受體細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化方法和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，特別是近年來研制的基因槍和電激儀克服了某些克隆載體應(yīng)用的物種局限性，提高了外源DNA轉(zhuǎn)化的效率。圍繞基因的檢測方法，在放射性同位素標(biāo)記探針的基礎(chǔ)上，近年來又發(fā)展了非放射性標(biāo)記DNA探針技術(shù)和熒光探針技術(shù)，如生物素標(biāo)記DNA探針、Dig標(biāo)記DNA探針、熒光素標(biāo)記DNA探針等。

第16頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

PCR技術(shù)的發(fā)展提高了基因檢測的靈敏度，為分離基因提供了快速簡便的途徑。PCR技術(shù)自從1985年建立以來，發(fā)展很快，除一般采用的常規(guī)PCR技術(shù)外還發(fā)展了多種特殊的PCR技術(shù)，如長片段PCR技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)、免疫PCR技術(shù)、套式引物PCR技術(shù)、反向PCR技術(shù)、標(biāo)記PCR技術(shù)、復(fù)合PCR技術(shù)、不對稱PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、錨定PCR技術(shù)、重組PCR技術(shù)、加端PCR技術(shù)等等。凝膠電泳技術(shù)可以在凝膠板上把不同分子大小的DNA分子或DNA片段分開，但是只能分辨幾萬堿基的DNA分子或片段。脈沖電泳技術(shù)的問世，不僅能分開上百萬堿基的DNA分子或片段，而且能夠使完整的染色體彼此分開。第17頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

2應(yīng)用研究基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)、農(nóng)、牧、漁等產(chǎn)業(yè)，甚至與環(huán)境保護(hù)也有密切的關(guān)系。研究成果最顯著的是基因工程藥物，轉(zhuǎn)基因植物的研究也取得了喜人的成果。第18頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

在農(nóng)業(yè)的應(yīng)用

應(yīng)用重組DNA技術(shù)培育具有改良性狀的糧食作物的工作已初見成效。現(xiàn)在已經(jīng)培育成功了一批分別具有抗病、抗蟲和抗除草劑性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。例如，應(yīng)用反義RNA技術(shù)培育成功的具有耐貯藏的轉(zhuǎn)基因西紅柿已開始在美國投放市場。利用植物合成微生物甚至哺乳動物的一些特殊蛋白質(zhì)，例如干擾素、人血清蛋白等也已有—些成功的報(bào)道。從理論上講，在將來還有可能通過轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)更多的藥用蛋白質(zhì)。我們有理由相信，重組DNA技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，是具有光輝的前景的。第19頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

重組DNA技術(shù)顯著特點(diǎn):可以使一個(gè)生物獲得與之固有性狀完全無關(guān)的新功能，從而引起生物技術(shù)學(xué)發(fā)生革命性的變革，使人們可以在大雖擴(kuò)增的細(xì)胞中生產(chǎn)哺乳動物的蛋白質(zhì)，其意義無疑是相當(dāng)重大的。

將控制這些藥物合成的目的基因克隆出來，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌或其它生物體內(nèi)進(jìn)行有效的表達(dá)，于是就可以方便地提取到大量的有用藥物。目前在這個(gè)領(lǐng)域中已經(jīng)取得了許多成功的事例，其中最突出的要數(shù)重組胰島素的生產(chǎn)。

第20頁,共172頁，2024年2月25日，星期天在醫(yī)藥業(yè)的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因細(xì)菌生產(chǎn)激素類藥物轉(zhuǎn)基因細(xì)菌生產(chǎn)抗生素：轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)疫苗：在工業(yè)原料生產(chǎn)上的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)高分子多聚物轉(zhuǎn)基因微生物與環(huán)境凈化和廢料再生第21頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

四基因工程的安全性

1基因工程的安全隱患

對環(huán)境的影響:重新組合一種在自然見尚未發(fā)現(xiàn)的的生物性狀有可能給現(xiàn)有的生態(tài)環(huán)境帶來不良影響。

新型病毒的出現(xiàn):

制造帶有抗生素抗性基因或有產(chǎn)生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人類或其它生物體內(nèi)傳播。

癌癥擴(kuò)散:

將腫瘤病毒或其它動物病毒的DNA引入細(xì)菌有可能擴(kuò)大癌癥的發(fā)生范圍。

人造生物擴(kuò)散:

新組成的重組DNA生物體的意外擴(kuò)散可能會出現(xiàn)不同程度的潛在危險(xiǎn)。第22頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

2控制措施

對轉(zhuǎn)基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。

物理的方法就是通過各種嚴(yán)格的管理措施和物理屏障盡量使轉(zhuǎn)基因生物不能從實(shí)驗(yàn)室逃逸進(jìn)入到自然環(huán)境里去。這種措施只能用于控制在實(shí)驗(yàn)室里的轉(zhuǎn)基因生物，而且用于控制轉(zhuǎn)基因微生物和通過花粉進(jìn)行擴(kuò)散的植物的效力實(shí)際上是非常有限的。當(dāng)轉(zhuǎn)基因動、植物必須用于開放的環(huán)境里生產(chǎn)時(shí)，物理控制的方法便不再有實(shí)際的意義。

第23頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

根本性的措施還是生物學(xué)的控制方法。即造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離。如利用三倍體不育的特性，將用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物或植物成為三倍體，這樣，轉(zhuǎn)基因生物在進(jìn)入到自然環(huán)境里后就不可能自行繁殖，因此也就不可能對生態(tài)系統(tǒng)造成長期的影響。也可以利用生理學(xué)原理，如激素誘導(dǎo)等方法使轉(zhuǎn)基因生物不育等。第24頁,共172頁，2024年2月25日，星期天1什么是基因工程技術(shù)?2基因工程基礎(chǔ)研究的有哪些內(nèi)容?第25頁,共172頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)及其應(yīng)用第26頁,共172頁，2024年2月25日，星期天PCR的反應(yīng)原理PCR的類型和應(yīng)用PCR示例第27頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。第28頁,共172頁，2024年2月25日，星期天體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（IIIIII）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB

引物dNTPMg2+5’3’第29頁,共172頁，2024年2月25日，星期天Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第30頁,共172頁，2024年2月25日，星期天Taq

DNA聚合酶（水生棲熱菌(Thurmusaquaticus，簡稱Taq)

)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。第31頁,共172頁，2024年2月25日，星期天PCR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸第32頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火第34頁,共172頁，2024年2月25日，星期天TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反應(yīng)緩沖液輔助因子：Mg2+第35頁,共172頁，2024年2月25日，星期天1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。

DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。

PCR反應(yīng)條件第36頁,共172頁，2024年2月25日，星期天（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。第37頁,共172頁，2024年2月25日，星期天（4）dNTP

dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。第38頁,共172頁，2024年2月25日，星期天（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。

Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。

Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。第39頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94℃，20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。第40頁,共172頁，2024年2月25日，星期天（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加第41頁,共172頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍第42頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。第43頁,共172頁，2024年2月25日，星期天引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。第44頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3）操作簡便易行

利用PCR擴(kuò)增,只需要數(shù)小時(shí),就可以擴(kuò)增出可用電泳法檢出的DNA，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。

第45頁,共172頁，2024年2月25日，星期天1）不對稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針；基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

PCR的類型第46頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

高濃度引物低濃度引物第47頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2)反向PCR(reversePCR)

用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。

未知序列未知序列已知序列第48頁,共172頁，2024年2月25日，星期天已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶第49頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。第50頁,共172頁，2024年2月25日，星期天電泳引物12341234第51頁,共172頁，2024年2月25日，星期天4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測多種基因成分第52頁,共172頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物第53頁,共172頁，2024年2月25日，星期天5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增第54頁,共172頁，2024年2月25日，星期天cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC第55頁,共172頁，2024年2月25日，星期天6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作第56頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共172頁，2024年2月25日，星期天7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。第58頁,共172頁，2024年2月25日，星期天操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)第59頁,共172頁，2024年2月25日，星期天8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增第60頁,共172頁，2024年2月25日，星期天9)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)第61頁,共172頁，2024年2月25日，星期天5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第62頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀第63頁,共172頁，2024年2月25日，星期天PCR示例一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)PCR分析的原理與技術(shù)。第64頁,共172頁，2024年2月25日，星期天1、材料：含1Kb插入片段的克隆載體Pmd18-T

質(zhì)粒DNA2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR 反應(yīng)緩沖液

25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑第65頁,共172頁，2024年2月25日，星期天1.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水補(bǔ)充至25.0μL三、操作步驟第66頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水補(bǔ)充至25.0μL三、操作步驟第67頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3.反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液與凝膠電泳緩沖液按比例混勻,上樣電泳。三、操作步驟瓊脂糖凝膠電泳第69頁,共172頁，2024年2月25日，星期天TheEnd！第70頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共172頁，2024年2月25日，星期天分子雜交技術(shù)

互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。第72頁,共172頁，2024年2月25日，星期天一.分子雜交種類

1.按其分子種類劃分

1）DNA雜交—探針為DNA或RNA

2）RNA雜交—探針為DNA或cDNA3）蛋白質(zhì)免疫分析—探針為抗體第73頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2.按樣品制備過程劃分

1）原位雜交(insituhybridization)

i.原位菌落雜交

ii.原位噬菌斑雜交

iii.原位細(xì)胞雜交

iv.原位組織塊雜交原位裂解細(xì)胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品，可同時(shí)處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測某類細(xì)胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。2）斑點(diǎn)雜交(dothybridization)

先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點(diǎn)在固體基質(zhì)上進(jìn)行雜交，不能測定分子量大小。第74頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3）轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blottinghybridization)

先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有：

i.擴(kuò)散法

ii.毛細(xì)管法

iii.電泳轉(zhuǎn)移法

iv.真空轉(zhuǎn)移法

4)夾心雜交法(sandwichhybridization)它利用兩種探針與待測DNA結(jié)合，先將不帶標(biāo)記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標(biāo)記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測出0.2ng的DNA樣品第75頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3.分子雜交的一般程序

1)DNA和RNA的雜交制備DNA或RNA樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→80℃真空固定→預(yù)雜交→加入標(biāo)記探針雜交→洗滌→放射自顯影或顯色反應(yīng)。

2）蛋白質(zhì)的免疫分析制備蛋白質(zhì)樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→常溫空氣中固定→封閉劑封閉→一抗反應(yīng)→洗滌→二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)→洗滌→顯色反應(yīng)（EIA）或→一抗放射標(biāo)記物→洗滌→放射自顯影（RIA）二.雜交樣品膜的制備

1.固定基質(zhì)的種類與特性

1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulosefilter,NCF)

可與三類大分子的結(jié)合，其機(jī)理不清楚，可能為被動吸附。NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（<20,000）第76頁,共172頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：i.用于DNA，RNA雜交分析時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。

ii.用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要預(yù)激活；易于操作缺點(diǎn)：結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次）

2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙最大特點(diǎn)是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同探針進(jìn)行多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)記物。這類基質(zhì)對生物大分子是主動吸附。

3)尼龍膜

i.陽離子尼龍膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）第77頁,共172頁，2024年2月25日，星期天i)容量大,蛋白質(zhì)可結(jié)合480μg/cm2ii)可結(jié)合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白質(zhì)。

iii)韌性好

iv)可用于電轉(zhuǎn)移

v)可進(jìn)行反復(fù)多次雜交試驗(yàn)

vi)廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒*不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。

ii.尼龍66

廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時(shí)陽離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時(shí)陰離子狀態(tài)，電轉(zhuǎn)移時(shí)要注意。

4）離子膜

i.DEAE-纖維素紙(可用于ss-DNA,ds-DNA,RNA的制備回收)ii.CM-纖維素紙(可用于堿性蛋白質(zhì)的結(jié)合)第78頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2.固定基質(zhì)的選擇依據(jù)

1）強(qiáng)度，耐久性，操作簡便

2）高信噪比（低本底高信號）

3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性

4）重現(xiàn)性好3.各種雜交樣品膜的制備

1）原位雜交樣品膜的制備

i.原位菌落雜交樣品膜第79頁,共172頁，2024年2月25日，星期天i)細(xì)胞培養(yǎng)（高密度，幾百—十萬個(gè)菌落或低密度，幾百個(gè)以下）

ii)細(xì)菌細(xì)胞原位裂解與DNA變性

ii.原位噬菌斑雜交樣品膜

i)細(xì)胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）

ii)噬菌體轉(zhuǎn)移—用NCF作影印

iii)DNA變性與固定（與上同）第80頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

2）斑點(diǎn)雜交樣品膜的制備制備樣品→點(diǎn)樣→固定（可用斑點(diǎn)雜交儀或直接點(diǎn)樣）3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備

i.擴(kuò)散法（Difusionblottingmethod)第81頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

ii.毛細(xì)管法(Capillaryblottingmethod)Southern印跡第82頁,共172頁，2024年2月25日，星期天iii.電轉(zhuǎn)移法(electroblotting)iv.真空轉(zhuǎn)移法(Vaccumbllotting)

轉(zhuǎn)移速度與凝膠的速度和厚度成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時(shí)，真空法比毛細(xì)管法快13倍，其損失僅6%，而毛細(xì)管法損失率20%。第83頁,共172頁，2024年2月25日，星期天v.各種轉(zhuǎn)移方法的比較

i)擴(kuò)散法和毛細(xì)管法：操作簡便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。

ii)電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。

iii)真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。vi.轉(zhuǎn)移的最佳條件

i)固定基質(zhì)的選擇

ii)轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。

iii)大分子的轉(zhuǎn)移對于分子量較大的DNA片段，必須進(jìn)行原位斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長度為1-2kb。第84頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

其步驟是：0.25MHCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）→水洗→0.5MNaOH/1MNaCl兩次，每次15分鐘→轉(zhuǎn)移。對于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一：

解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。三.標(biāo)記探針的制備

1.標(biāo)記化合物的種類

1）放射性同位素標(biāo)記物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)記；32P，3H，35S 用于核酸標(biāo)記，其中32P和35S使用頻率高。32P標(biāo)記核苷酸的α位或γ位，35S則是標(biāo)記核苷酸的α位.第85頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2)非放射性標(biāo)記物

i.生物素分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白—抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)合4個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，可大大提高其靈敏度。生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合形成標(biāo)記化合物。

ii.半抗原包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測上述標(biāo)記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。第86頁,共172頁，2024年2月25日，星期天iii.蛋白質(zhì)檢測標(biāo)記物

i)酶偶聯(lián)二抗（0.05ng）

ii)蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）。可作用于大多數(shù)哺乳動物的IgG，靈敏度較低（5ng）

iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng3)兩類標(biāo)記化合物的比較

i.靈敏度i)檢測蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。

ii)檢測核酸，放射法比酶法敏感。

ii.穩(wěn)定性酶法探針可在4℃保存一年，放射性標(biāo)記需每次制備。

iii.安全性非放射性標(biāo)記安全。

iv.效率非放射性標(biāo)記所需時(shí)間短。第87頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2.標(biāo)記探針的制備

1）鏈標(biāo)記法

i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.隨機(jī)DNA引物延伸法

ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P)iii.反轉(zhuǎn)錄法

mRNA+dNTP(32P)→cDNA（標(biāo)記）iv.轉(zhuǎn)錄法

含有待標(biāo)記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)→SP6聚合酶→RNA（標(biāo)記）v.引物延伸法含待標(biāo)記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待標(biāo)記DNA鏈第88頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

vi.T4DNA聚合酶法

ds-DNA→T4DNA聚合酶,無dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和標(biāo)記核苷酸→新合成鏈（32P）

2)末端標(biāo)記

i.5’-末端標(biāo)記

ss-和ds-DNA,RNA→脫磷酸化反應(yīng)(CIP)→T4DNA激酶(γ-32P)ATPii.3’-末端標(biāo)記

i)TdT加尾反應(yīng)，用于dsDNAii)補(bǔ)齊反應(yīng)第89頁,共172頁，2024年2月25日，星期天iii)T4RNA連接酶反應(yīng)RNA-OH+*pNp（3’-5’-二磷酸核苷）+ATP—RNA-*pNPp+pA+ppi3)標(biāo)記化合物的純化

i.柱層析利用SephadexG-50，前峰-標(biāo)記物，后峰-核苷酸

ii.旋轉(zhuǎn)柱層析

快速，簡便,可同時(shí)純化多個(gè)樣品。

四.分子雜交與結(jié)果檢測

1.核酸雜交與結(jié)果檢測

1）預(yù)雜交：預(yù)雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標(biāo)記探針是cDNA或RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合,42℃4-6h或過夜。

2）雜交：探針100℃變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42℃一天第90頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3）洗滌：2×SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計(jì)算：T=4GC+2AT*高強(qiáng)度與低強(qiáng)度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強(qiáng)度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強(qiáng)度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強(qiáng)度以及雜交和洗滌時(shí)的溫度。4）放射自顯影或顯色反應(yīng)使用放射性同位素標(biāo)記物，采用放射自顯影。若采用非放射性同位素標(biāo)記物，則采用顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶：

i.辣根過氧化物酶:可將3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。第91頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第92頁,共172頁，2024年2月25日，星期天ii.堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應(yīng)中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點(diǎn)。

iii.兩種酶偶聯(lián)物的比較

i)堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。

ii)堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，其顯色結(jié)果可長期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù)30分鐘。

5)雜交結(jié)果2.蛋白質(zhì)的免疫分析封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。第93頁,共172頁，2024年2月25日，星期天雜交結(jié)果示意圖第94頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

核酸序列的測定第95頁,共172頁，2024年2月25日，星期天一.DNA的核苷酸序列分析

1.種類

1)酶法

i.加減法

ss單-DNA→與引物退火→加入4種dNTP和DNA聚合酶→分離純化ds-DNA→加減法定序系統(tǒng)測序。

加法系統(tǒng)：ds-DNA4份，每份中加入一種脫氧核苷酸和DNA聚合酶。

減法系統(tǒng)；ds-DNA4份，每份加入三種脫氧核苷酸和DNA聚合酶。該法操作復(fù)雜，讀序較難，但其前半部反應(yīng)可在其他定序方法中用于序列延伸。第96頁,共172頁，2024年2月25日，星期天ii.雙脫氧核苷酸鏈終止法(dideoxy-terminationsequencing)

原理：雙脫氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列。第97頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第98頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

過程：制備ss-DNA→與引物退火→分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)→每個(gè)系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標(biāo)記）和一種雙脫氧核苷酸→DNA聚合酶定序反應(yīng)→反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳→凝膠干燥→放射自顯影。`

該法也適合mRNA的序列分析。

GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應(yīng)中加入dITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序。

2)化學(xué)法

原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，然后發(fā)生堿基脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列。第99頁,共172頁，2024年2月25日，星期天i.嘌呤（A和G）序列測定

硫酸二甲酯處理DNA鏈時(shí)，G的7位和A的3位氮原子被甲基化，甲基化后的嘌呤環(huán)可被哌啶取代，從而導(dǎo)致鏈斷裂。由于G比A更易甲基化（5倍），且mG比mA更不穩(wěn)定，因而易發(fā)生鏈斷裂?？刂坪梅磻?yīng)溫度與時(shí)間，只使G反應(yīng)而A不反應(yīng)，從而可測出G序列。若用甲酯代替硫酸二甲酯，A與G均會發(fā)生反應(yīng)。比較兩反應(yīng)系統(tǒng)電泳結(jié)果，就可知道A的序列。

ii.嘧啶（C和T）序列的測定用肼處理ss-DNA時(shí)，可使嘧啶開環(huán)，被哌啶取代后而導(dǎo)致磷酸二酯鍵斷裂。若反應(yīng)在高鹽濃度下進(jìn)行，T與肼的反應(yīng)受抑制，因而可測得C的序列，比較加鹽與不加鹽反應(yīng)的結(jié)果，就可測定T的序列。該法的一大優(yōu)點(diǎn)是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待測DNA鏈的檢測用32p末端標(biāo)記。第100頁,共172頁，2024年2月25日，星期天哌啶硫酸二甲酯甲基化第101頁,共172頁，2024年2月25日，星期天肼哌啶第102頁,共172頁，2024年2月25日，星期天第103頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2.DNA定序的一般程序

酶法測序(Sanger)

化學(xué)測序法(Maxam-Gilbert)

待測DNA片段待測DNA片段

↓

↓次克隆5’-末端標(biāo)記

↓篩選重組子鏈分離限制酶切

↓模板增殖與純化↓

↓純化標(biāo)記的ss-DNA

與引物退火↓

↓定序反應(yīng)定序反應(yīng)

↓聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓真空干燥

↓放射自顯影

↓閱讀序列和計(jì)算機(jī)錄入

↓核苷酸序列的分析與比較第104頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

3.兩種定序方法的比較

1)化學(xué)法

i.優(yōu)點(diǎn):所有片段具有相同的標(biāo)記強(qiáng)度；一次可以讀出250-400個(gè)核苷酸；定序分析不需要次克??；不受二級結(jié)構(gòu)區(qū)的影響；多A區(qū)定序清楚；適合500bp或以下DNA片段的定序分析。

ii.缺點(diǎn):需限制酶圖；需放射自顯影時(shí)間較長和增感屏；DNA片段需經(jīng)凝膠純化；多嘧啶區(qū)定序不夠清楚；所用試劑為誘變劑和致癌物質(zhì)。

2)酶法

i.優(yōu)點(diǎn):反應(yīng)簡單，易于操作；具有配套載體和宿主菌；不一定需要詳盡的限制酶圖；可采用多種方法進(jìn)行次克隆。

ii.缺點(diǎn):DNA帶放射強(qiáng)度不均勻；下游堿基閱讀困難；需要大量的次克隆和鑒定工作；二級結(jié)構(gòu)區(qū)和多C區(qū)定序困難。定序方法的選擇主要依據(jù)所需測序DNA長度，實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?。?05頁,共172頁，2024年2月25日，星期天二.酶法定序系統(tǒng)

1.單鏈定序系統(tǒng)

1）M13mp

系列載體定序系統(tǒng)

i.從細(xì)菌細(xì)胞中獲得ds-DNA，以利待測DNA片段的重組，經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞；

ii.從培養(yǎng)液中可獲得病毒顆粒，從中提取ss-DNA用于測序，病毒顆粒經(jīng)感染將-DNA引入細(xì)胞；

iii.含有β-半乳糖甘酶α-鏈基因，易于重組子檢測；

iv.多克隆位點(diǎn)區(qū)有利于外源DNA插入，因配套載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)方向相反，有利于待測DNA端靠近載體上的引物變性區(qū)；

v.各種引物易于獲得；

vi.有與載體配套的各種宿主菌，如：E.coliJM系列，DH5αF’

等。第106頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

2)噬粒載體定序系統(tǒng)

該系統(tǒng)具上述M13mp系統(tǒng)的特點(diǎn)外，它容納的外源DNA片段較長；直接在同一重組分子進(jìn)行各種次克??；操作較簡單，同時(shí)亦可用于雙鏈定序。與M13mp系統(tǒng)相比較，噬粒載體系統(tǒng)有以下兩缺點(diǎn)：

i.形成單鏈時(shí)需輔助噬菌體，它亦可形成病毒顆粒；

ii.制備ss-DNA時(shí)需較大量培養(yǎng)液，而M13mp系列載體僅需

1.5ml培養(yǎng)液即可。

2.雙鏈定序系統(tǒng)任何一種質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體均可用于此目的，只要有適合的引物。該系統(tǒng)的一個(gè)最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，可進(jìn)行雙向定序，大大減少次克隆工作量。與單鏈定序系統(tǒng)相比較，該系統(tǒng)每次可閱讀序列較少，反應(yīng)中其他干擾較多。第107頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

3．測序引物，同位素和酶

1）引物正向引物與反向引物：凡是含有LacZα基因失活的標(biāo)記基因的各種載體，與多克隆位點(diǎn)區(qū)下游某序列可復(fù)性的引物稱為正向引物（forwardprimer）；反之，位于多克隆位點(diǎn)區(qū)上游的引物稱之為反向引物（reversedprimer）當(dāng)使用噬粒載體定序時(shí)，一定要注意包裝入噬菌體中單鏈?zhǔn)?或-鏈，相應(yīng)引物只能選用一種。第108頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

2）同位素如果是作鏈標(biāo)記，常用的同位素是[α-32P]-dATP或[α-35S]dATP，其放射比活性較低。如果是做引物標(biāo)記，則用[γ-32P]ATP。當(dāng)用PCR方法定序時(shí)，則常采用引物的5'-端標(biāo)記。

3）聚合酶

可用DNApolIK，TTDNA聚合酶，DNA定序酶，TagDNApol等。除上述因素外，不同測序系統(tǒng)中使用的dNTP/ddNTP比值對定序結(jié)果影響也很大。多克隆位點(diǎn)

第109頁,共172頁，2024年2月25日，星期天三.DNA序列的快速測定快速測定DNA序列應(yīng)同時(shí)從以下兩方面考慮：

i.每次定序反應(yīng)的核苷酸序列可讀數(shù)盡可能大，可大大減輕次克隆

(模板)的工作量；

ii.提高次克隆效率，使一次反應(yīng)就能獲得所需的全部重組體，盡量減少重組子鑒定步驟。

1.延伸DNA定序方法

ss-DNA模板→與引物退火→加入dNTP和DNApol反應(yīng)約5’（室溫）→分為4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行→雙脫氧核苷酸定序（37℃5分鐘）→凝膠電泳→放射自顯影→讀序。

2.DNA片段的次克隆方法第110頁,共172頁，2024年2月25日，星期天2）雙向缺失法1）限制酶切法必備條件：詳盡限制酶圖；各切點(diǎn)序列必須為另一次克隆片段測序時(shí)覆蓋。第111頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3）單向缺失法4）鳥槍法（隨機(jī)片段法）第112頁,共172頁，2024年2月25日，星期天

3.特殊缺失法

1）洪國藩法

2）郭禮和法第113頁,共172頁，2024年2月25日，星期天3）單鏈缺失法

第114頁,共172頁，2024年2月25日，星期天4.多引物測序4）直接順序缺失法第115頁,共172頁，2024年2月25日，星期天四.DNA序列測定的自動化

1.DNA測序步驟與自動化

1）模板制備可自動化

2）定序反應(yīng)可自動化

3）凝膠電泳自動化有一定困難：制膠，點(diǎn)樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。

4）核苷酸序列閱讀與計(jì)算機(jī)輸入可自動化

2.自動測序