流式細胞凋亡分析

關于流式細胞凋亡分析概念

細胞凋亡（apoptosis）是指有核細胞在一定條件下通過啟動其內(nèi)部自身機制，主要是通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細胞死亡過程。細胞凋亡是受基因控制的一種主動性細胞自殺過程，是生物體中一種普遍存在的現(xiàn)象。第2頁,共106頁，2024年2月25日，星期天概念

細胞凋亡是維持人體正常生理過程和功能活動所必需的，是多細胞生物生命活動過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是其藉以存活的需要，貫穿了生物全部生命周期中。第3頁,共106頁，2024年2月25日，星期天概念

細胞凋亡與細胞壞死（necrosis）是細胞死亡的兩種模式，但兩者有明顯的區(qū)別。后者是由于細胞受到嚴重損傷或或大劑量細胞毒藥物作用后發(fā)生的被動分解過程，并可導致周圍組織的炎癥反應。第4頁,共106頁，2024年2月25日，星期天概念細胞凋亡的作用主要包括以下幾方面：清除無功能的細胞；控制細胞數(shù)量；清除病態(tài)的或有害的細胞；清除多余的細胞；第5頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：光鏡下，凋亡細胞最突出的形態(tài)學特征是細胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細胞變圓皺縮而細胞膜保持完整，其中胞核變化尤為突出。染色質(zhì)的濃集可能是由于凋亡細胞核雙鏈DNA發(fā)生裂解所致。第6頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：

DNA降解后，形成長度主要為180-200bp的DNA片斷，隨后細胞裂解成許多有膜包被的小體，稱為凋亡小體（apoptoticbodies),最后被巨噬細胞吞噬，但不會引起周圍組織的炎癥反應。凋亡小體是凋亡細胞特征性的標志。如在顯微鏡下觀察到凋亡小體，則可確認為細胞發(fā)生了凋亡。第7頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：電鏡下，細胞核內(nèi)可見高電子密度區(qū)，這是核DNA在核小體連接處斷裂成核小體后，在異染色質(zhì)區(qū)聚集形成的染色質(zhì)濃縮塊。染色質(zhì)聚集區(qū)以外的低電子密度區(qū)為透明區(qū)，是由于核孔變大導致其通透性增加，細胞質(zhì)中水分不斷滲入而造成。線粒體增殖，呈空泡化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴大，為凋亡細胞形成自噬體提供包裹膜。細胞骨架變得致密、紊亂。第8頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：

第9頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：

第10頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：共聚焦顯微鏡觀察，凋亡細胞膜電位和線粒體膜電位下降，膜流動性降低。細胞膜上新出現(xiàn)了一些生物大分子如磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，這些分子的出現(xiàn)與凋亡細胞的清除有關。

第11頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征形態(tài)學特征：

凋亡細胞另一個形態(tài)特征通過總DNA提取，DNA凝膠電泳分析，可呈現(xiàn)出梯狀圖譜，可見清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。

第12頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程也可能是水解酶級聯(lián)切割的過程，它將大分子結(jié)構的物質(zhì)如DNA、細胞骨架水解變性成小分子碎片，致使細胞發(fā)生凋亡。第13頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：其中，半胱氨酸蛋白酶家族發(fā)揮了重要作用。它具有一段攜帶活化位點的保守氨基酸序列，可以特異性識別、切割天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶殘基。由于這些蛋白酶具有相同的結(jié)構和功能特性而被稱為caspase。第14頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：

caspase可能在凋亡細胞的形態(tài)變化中起了主導作用。Caspase通常是以酶原形式存在，通過其自身誘發(fā)的蛋白水解而轉(zhuǎn)化為有活性的酶，活化的caspase進一步激活其他的caspase前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，裂解重要的大分子物質(zhì)，導致凋亡。第15頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：目前已發(fā)現(xiàn)15個caspase家族成員，分別命名為caspase-1～15，并根據(jù)其功能特點分成兩類，即啟動caspase(caspase-2、8、9、10）和效應caspase(caspase3、6、7）。第16頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：啟動caspase作用于凋亡信號觸發(fā)后上游的不可逆位點。效應caspase由啟動胱冬肽酶激活，作用于下游的執(zhí)行位點，裂解細胞成凋亡小體。分子結(jié)構相互聯(lián)系的這兩部分影響線粒體，通過線粒體方式執(zhí)行凋亡的信號。bcl-2家族成員能調(diào)節(jié)執(zhí)行位點的進程。第17頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：1caspase蛋白酶：

caspase-3是最重要的指示蛋白酶，為17kD和12kD亞單位組成的異二聚體。活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他caspase、相關的胞質(zhì)靶位點（細胞因子18，CK18)和細胞核靶位點。Caspase-3切割CK18是凋亡過程中caspase切割發(fā)生的早期指示因子。

第18頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：2核酸內(nèi)切酶的激活：細胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將核小體間連接DNA降解，形成長度主要為180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，組蛋白和其他核內(nèi)蛋白質(zhì)不降解，核基質(zhì)也不改變。在DNA凝膠電泳分析中呈現(xiàn)出特征性“梯狀”條帶，而細胞壞死時，DNA片斷大小不一，無“梯狀”條帶出現(xiàn)。但并非所有凋亡細胞都能檢測到這種典型的生化特征。

第19頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：2核酸內(nèi)切酶的激活：

第20頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：3線粒體的變化：線粒體發(fā)生的重要改變之一就是凋亡誘導因子使線粒體通透性升高，膜上巨型通道開放，使線粒體蛋白進入細胞液中，線粒體膜兩側(cè)質(zhì)子不對稱性消失，線粒體膜電位迅速下降，電子傳遞與呼吸鏈解偶聯(lián)。

第21頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：3線粒體的變化：線粒體膜電位的變化發(fā)生在細胞凋亡的早期。線粒體膜電位是由于其內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子和其他離子分布不對稱造成的。線粒體參與了凋亡的調(diào)控和實施。與凋亡密切相關的bcl-2家族分布在細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，其中線粒體外膜上分布最多，bcl-2具有抑制線粒體通透性變化的能力，并通過此途徑抑制細胞凋亡。

第22頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：4胞質(zhì)Ca2+和pH的變化：細胞內(nèi)Ca2+和H+濃度的穩(wěn)定對維持生命活動至關重要。胞內(nèi)Ca2+庫的釋放，胞質(zhì)Ca2+與細胞凋亡關系密切。胞外Ca2+內(nèi)流促使胞質(zhì)Ca2+持續(xù)升高，作為凋亡信號啟動凋亡發(fā)生。

第23頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：4胞質(zhì)Ca2+和pH的變化：此外，Ca2+的釋放打破了細胞內(nèi)結(jié)構的穩(wěn)定，使得細胞凋亡效應系統(tǒng)的關鍵成分開始和細胞結(jié)構正常時不能接觸到的基質(zhì)接觸，從而觸發(fā)細胞凋亡。

第24頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的特征生化特征：4胞質(zhì)Ca2+和pH的變化：細胞pH的變化可影響細胞凋亡。細胞凋亡時伴隨胞質(zhì)pH降低，胞質(zhì)酸化影響細胞凋亡。胞質(zhì)pH降低可能與胞質(zhì)Ca2+升高有關。胞質(zhì)酸化主要通過激活酸性DNaseⅡ啟動細胞凋亡。pH降低也影響了一些酸性功能蛋白在細胞凋亡過程中的作用。

第25頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的基因調(diào)控

細胞凋亡受基因的調(diào)控，其機制非常復雜。凋亡基因可分為兩類：1誘導基因：野生型p53基因、c-myc、細胞表面抗原基因Apo-1(Fas)等2抑制基因：bcl-2、突變型p53基因和ras基因等第26頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的基因調(diào)控

上述兩類基因蛋白產(chǎn)物的表達對凋亡起重要調(diào)控作用。誘導基因蛋白產(chǎn)物表達上調(diào)，可提高細胞對凋亡信號的敏感性，促進凋亡發(fā)生。抑制基因蛋白產(chǎn)物表達，可降低細胞對凋亡信號的敏感性，抑制或推遲凋亡。第27頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的基因調(diào)控

誘導與抑制凋亡兩大基因蛋白表達的平衡，可對細胞的增殖、分化和死亡進行調(diào)控，維持細胞群體的正常穩(wěn)定性。當調(diào)控失衡時，就會導致疾病，如腫瘤、AIDS、霍奇金淋巴瘤等。第28頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的基因調(diào)控常見的凋亡基因及其蛋白：1bcl-2是研究最早的與凋亡有關的基因。bcl-2基因是一種對細胞凋亡具有明顯抑制作用的癌基因。它是阻止細胞死亡的最后途徑，而對細胞周期無明顯影響。它能抑制由許多因子，如化療藥物、某些病毒、p53、c-myc及生長因子等激發(fā)的凋亡。第29頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的基因調(diào)控常見的凋亡基因及其蛋白：2p53p53基因不僅是一種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關的抑癌基因，而且參與細胞生長、分化及死亡的調(diào)控。P53在調(diào)節(jié)凋亡中起重要作用。正常細胞和腫瘤細胞在受到紫外線或gamma射線照射后，含正常p53的細胞，可發(fā)生凋亡，而p53基因缺失或突變的細胞則表現(xiàn)出對電離射線和化療藥物的抗性。野生型p53對凋亡起促進作用，突變型p53對凋亡起抑制作用。第30頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的基因調(diào)控常見的凋亡基因及其蛋白：3Fas和Fas配體Fas是腫瘤壞死因子（TNF）受體和神經(jīng)生長因子受體家族的細胞表面分子。Fas配體（Fasligand,FasL)是TNF家族的細胞表面分子。FasL與其受體Fas結(jié)合導致攜帶Fas的細胞凋亡?？笷as抗體、表達FasL的細胞和可溶性的FasL與Fas交聯(lián)均產(chǎn)生細胞凋亡信息，而bcl-2過度表達能抑制Fas致凋亡作用。第31頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與腫瘤：以往，細胞增殖的失調(diào)、細胞分化與增殖紊亂被認為是惡性腫瘤的發(fā)生機制。近來，人們認識到在腫瘤細胞快速增殖過程中，同時也發(fā)生凋亡，增殖與凋亡之間的平衡有可能決定著腫瘤的生長速度。細胞凋亡的減少，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。第32頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與腫瘤：凋亡調(diào)節(jié)基因的紊亂、凋亡機制蛋白的增加是腫瘤形成的重要機制。用于調(diào)控腫瘤細胞凋亡的基因主要有bcl-2基因家族、p53基因、Fas基因家族和c-myc基因家族。第33頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與腫瘤：許多腫瘤，尤其是消化道腫瘤常可見凋亡的發(fā)生。凋亡在胃粘膜發(fā)生腸上皮化生等病變中起決定性作用，但胃癌的凋亡指數(shù)低于慢性胃炎和胃潰瘍。因此，胃粘膜病變細胞凋亡減少、生存期延長、細胞大量堆積可能是胃癌發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移的基礎。第34頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與腫瘤：凋亡還可能與胃癌的血管生成有關。凋亡指數(shù)與腫瘤內(nèi)部微血管密度成負相關，并與胃癌的組織類型有關。第35頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。涸S多以免疫功能異常為主要特征的疾病均存在細胞凋亡現(xiàn)象。細胞凋亡在免疫形態(tài)的發(fā)生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的發(fā)生中起重要作用。第36頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。寒?shù)蛲鲞^少、炎癥反應過強時，易造成變態(tài)反應或自身免疫病。當?shù)蛲鲞^多，機體免疫力下降時，容易繼發(fā)感染與腫瘤。在細胞凋亡過程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之間的相互作用起了重要作用。它們通過激活T淋巴細胞的自殺或殺傷激活的B淋巴細胞，進一步調(diào)節(jié)免疫反應的強弱。第37頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾病：當?shù)蛲鲞^少、炎癥反應過強時，易造成變態(tài)反應或自身免疫病。當?shù)蛲鲞^多，機體免疫力下降時，容易繼發(fā)感染與腫瘤。在細胞凋亡過程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之間的相互作用起了重要作用。它們通過激活T淋巴細胞的自殺或殺傷激活的B淋巴細胞，進一步調(diào)節(jié)免疫反應的強弱。第38頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與免疫系統(tǒng)疾?。航鼇硌芯堪l(fā)現(xiàn)，淋巴細胞凋亡作用的缺陷與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。淋巴細胞凋亡的缺陷常是自身基因調(diào)控異常的結(jié)果。目前已明確定義為自身基因的有Fas和bcl-2等。第39頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與皮膚?。耗承┢つw病是以凋亡的增加為特征。銀屑病表皮的基底膜上層中觀察到凋亡的形態(tài)學和生化特征。plaque基底細胞層bcl-2陽性細胞數(shù)顯著下降。第40頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病細胞凋亡與皮膚病：自身免疫性皮膚病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫異常與自身反應性T、B淋巴細胞凋亡缺陷有關。惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡基因調(diào)控失常而導致凋亡障礙有關。此外，細胞凋亡與皮膚腫瘤自動消退有關。第41頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病缺血性腦損傷和缺血性心臟?。阂酝?，腦缺血導致的細胞死亡被認為是由于神經(jīng)元廣泛壞死所致。近來研究表明，全腦或局部腦梗死均激活細胞凋亡過程。大腦半球短暫缺血后，缺血中心區(qū)域神經(jīng)細胞很快壞死，但周圍的神經(jīng)細胞，以海馬CAI區(qū)的錐形細胞最為明顯，要經(jīng)過一個潛伏期才出現(xiàn)延遲性神經(jīng)細胞退化，即細胞凋亡。第42頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病缺血性腦損傷和缺血性心臟病：這種凋亡發(fā)生在缺血后1-2天，并在缺血周邊區(qū)域出現(xiàn)bcl-2蛋白的表達。而且，不僅在神經(jīng)細胞，在膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和血管壁中也有表達，這提示非致死性的損傷導致細胞產(chǎn)生bcl-2，以抵抗細胞的凋亡。此外，在缺血后的腦組織中檢測到Fas抗原mRNA明顯增加，提示Fas在凋亡中起一定作用。第43頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病缺血性腦損傷和缺血性心臟?。撼思毎麎乃酪酝?，凋亡也是缺血性心肌細胞死亡的重要方式。在體心臟實驗表明，再灌注損傷和心肌梗死均能誘發(fā)心肌細胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗死的大小取決于細胞凋亡的嚴重程度，凋亡可能是缺血性心臟病演化為心力衰竭的細胞學機制。第44頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病感染性疾病：

HIV感染可導致AIDS。其感染的細胞學特征是特異性破壞CD4+T淋巴細胞，造成相關免疫功能缺陷，導致感染和腫瘤。在HIV感染過程中，從HIV對CD4+T淋巴細胞黏附、病毒顆粒進入細胞、HIV基因組在細胞中復制和裝配以及出芽釋放等環(huán)節(jié)，都與細胞凋亡密切相關。第45頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病其他疾?。耗I小球腎炎和狼瘡腎炎動物模型中均發(fā)現(xiàn)凋亡細胞，這些凋亡細胞可能與腎小球硬化和腎功能衰竭有關。血管動脈粥樣硬化形成過程中，平滑肌細胞的增殖與凋亡同時存在，凋亡對內(nèi)皮損傷、增殖抑制、粥樣病灶的形成和斑塊的剝脫有一定的影響。

第46頁,共106頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與疾病

通過對各種疾病細胞凋亡的研究，使我們對疾病的發(fā)生機制有了新的認識，同時也為疾病的治療提供了新的思路。

第47頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測凋亡細胞的形態(tài)學變化是細胞發(fā)生凋亡時最可靠的證據(jù)，其直接檢測方法主要是通過對組織或細胞進行各種染色，然后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。

第48頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測凋亡細胞的形態(tài)學變化是細胞發(fā)生凋亡時最可靠的證據(jù)，其直接檢測方法主要是通過對組織或細胞進行各種染色，然后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察。如通過蘇木素-伊紅（HE)染色、吉姆薩（Giemsa)染色、甲基綠-哌諾寧染色在普通光學顯微鏡下觀察；通過熒光染料如丫啶橙（AO)、Heochst33258染色在熒光顯微鏡下觀察；或制成超薄切片用電子顯微鏡觀察，以區(qū)別凋亡和壞死。

第49頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測

FCM可間接觀察凋亡細胞形態(tài)學變化，主要是根據(jù)未經(jīng)染色的凋亡細胞的光散射特征進行檢測。

第50頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測

FCM提供的散射光參數(shù)主要包括前向散射光（FSC）和測向散射光（SSC）。FSC主要與細胞大小有關，對同一個細胞群體，散射光強的，其細胞大一些，散射光弱的，其細胞小一些。SSC主要與細胞內(nèi)部顆粒密度有關，顆粒密度越大，SSC就越大，而顆粒密度越小，SSC就越小。

第51頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測當細胞發(fā)生凋亡的早期，細胞膜完整、細胞皺縮，因此這一階段凋亡細胞FSC較活細胞小，而SSC較之增強或無明顯變化。

第52頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測當細胞凋亡進一步發(fā)展時，細胞皺縮更加明顯，核質(zhì)的變化導致細胞內(nèi)顆粒密度明顯增強，F(xiàn)SC進一步變小，而SSC卻明顯增大。最終，當?shù)蛲鲂◇w形成時，F(xiàn)SC明顯縮小。

第53頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測此外，也可通過FSC區(qū)分壞死細胞和凋亡細胞。細胞壞死時，由于細胞腫脹，其FSC增大，SSC在細胞壞死時也增大。但晚期凋亡細胞的FSC和SSC與壞死細胞區(qū)分不明顯。當壞死細胞的細胞膜破裂，核質(zhì)丟失，細胞成為碎片時，其FSC和SSC均明顯變小。第54頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡第55頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡形態(tài)學特征檢測但實際上，由于被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核/質(zhì)比例不同，凋亡不同階段的細胞，其光散射參數(shù)的變化不同，有時很難準確檢測到凋亡細胞。但將光散射參數(shù)與熒光標記的抗體或熒光染料結(jié)合起來檢測細胞凋亡，可以克服單純的光散射參數(shù)的缺點。第56頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測凋亡細胞的一個重要特點是很長一段時間里細胞膜結(jié)構未受影響，其主要表現(xiàn)為：維持膜的基本功能，如離子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。第57頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測根據(jù)不同功能狀態(tài)下的細胞對染料的吸收或排斥作用不同，可用流式細胞儀定量檢測活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的百分比。第58頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測處于早/中期的凋亡細胞，仍然保持著完整的質(zhì)膜及其基本功能，阻礙大分子物質(zhì)及離子進入細胞內(nèi)。而晚期凋亡細胞或壞死細胞，其質(zhì)膜完整性受到破壞，使某些大分子物質(zhì)及離子可以進入細胞內(nèi)。因此，根據(jù)對DNA染料通透性的不同，可區(qū)分處于不同階段的細胞。第59頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測

PI和EB均屬于插入性熒光染料，可選擇性的定量嵌入核酸雙螺旋的堿基之間，其熒光發(fā)射均為橙紅色，如果使用氬離子激光488nm激發(fā)，PI的發(fā)射光譜波長在610-620nm范圍，EB的發(fā)射光譜波長在603-610nm之間，二者可互相替代，但EB毒性較大。第60頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測

7-氨基-放線菌素D（7-AAD）主要以插入方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，其激發(fā)波長約為580nm，最大發(fā)射波長為660nm，由于其發(fā)射波長較大，可與藻紅蛋白（PE）結(jié)合，通過單一光譜488nm的激光光源激發(fā)，可以進行定量DNA和免疫熒光的雙參數(shù)分析。第61頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測由于EB、PI和7-AAD不能進入具有完整細胞膜的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在未固定時對這些染料是拒染的，而壞死細胞胞膜完整性已破壞，可被染色。因此，這些染料可被用來鑒別死細胞和活細胞。第62頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測赫斯特類染料（特別是HO33342)檢測細胞凋亡的原理與上述染料不同。HO33342是雙苯并咪唑家族成員之一，能特異與DNA螺旋中富含A-T重復序列結(jié)合。HO33342用氪激光激發(fā)紫外線熒光，激發(fā)光波長為352nm，發(fā)射光波長為400-500nm，產(chǎn)生藍色熒光。第63頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測

HO33342能被活細胞攝取，而其從細胞內(nèi)排出是一個耗能的主動過程，依賴細胞膜上的P-糖蛋白泵?；罴毎旧珪r，應考慮是否存在細胞抗藥性問題，如有耐藥性，則染色效果不佳。HO33342進入凋亡細胞比正常細胞多，將其與PI結(jié)合對凋亡細胞進行雙染，可將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)分開來。第64頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞對染料吸收能力的檢測在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現(xiàn)為：正常細胞低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。第65頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡caspase的流式細胞儀檢測

caspase家族在細胞凋亡過程中起著重要作用，通過caspase對大分子結(jié)構的瀑布級聯(lián)水解反應，導致凋亡發(fā)生。其中caspase-3是最重要的指示蛋白酶，活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他的caspase、相關胞質(zhì)的靶位點（CK18）等。Caspase-3切割細胞因子，尤其是CK18，是凋亡過程中caspase切割發(fā)生的早期指示因子。第66頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡第67頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡caspase的流式細胞儀檢測

caspase-3的活性在細胞凋亡發(fā)生前是檢測不到的，只有在凋亡早期才能檢測到。隨后在凋亡的過程中持續(xù)升高，在凋亡晚期快速下降。因此，對caspase-3的連續(xù)檢測可動態(tài)觀察凋亡的整個過程。第68頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡線粒體功能的檢測線粒體被認為是凋亡生化反應的基地，因為它可能是決定細胞存活或死亡的中心。線粒體的一個重要作用是在外膜形成通透性通道孔（線粒體大通道），允許線粒體內(nèi)的蛋白流入胞質(zhì)。線粒體大通道的開放，導致質(zhì)子在內(nèi)膜兩側(cè)的不對稱分布被破壞，即線粒體跨膜電位（TMP）被轉(zhuǎn)變。第69頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡線粒體功能的檢測

TMP的變化是凋亡早期特有的現(xiàn)象。TMP由膜內(nèi)外包括質(zhì)子在內(nèi)的離子形成的。內(nèi)膜內(nèi)面帶負電，因此帶正電的親脂性熒光素會集中分布于線粒體基質(zhì)。凋亡早期TMP的變化導致其聚集熒光色素的能力喪失。其發(fā)生要早于DNA斷裂和PS外翻。第70頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡線粒體功能的檢測

TMP的變化可通過適于流式細胞儀檢測的熒光染料來檢測。多種膜通透性親脂陽離子熒光色素，如羅丹明123（RH123）被用于流式細胞儀檢測TMP的探針。當它們與活細胞一起培養(yǎng)時，探針被聚集于線粒體，通過測定細胞熒光色素的強度及外流來反映TMP的變化。第71頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡線粒體功能的檢測位于線粒體的啟動凋亡和抑制凋亡的bcl-2/bax家族蛋白通過形成同源性或異源性二聚體在線粒體跨膜電位的調(diào)控中起重要作用。所有bcl-2家族蛋白都可通過特異性抗體進行FCM測定。第72頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡線粒體功能的檢測線粒體在凋亡時的變化及與bcl-2家族蛋白之間的相互作用發(fā)生于凋亡早期，影響細胞對凋亡的敏感性。bcl-2家族蛋白可能影響抗腫瘤治療的轉(zhuǎn)歸。因此，流式細胞儀檢測這些變化，在腫瘤學上具有一定意義。第73頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞內(nèi)Ca2+的檢測細胞發(fā)生凋亡時，其胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，pH調(diào)節(jié)能力喪失，導致細胞磷酸化。目前有許多檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度的方法，但通過流式細胞儀采用Ca2+選擇性的熒光探針（Flu-3）檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度仍是最佳方法。第74頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞DNA含量的檢測使用PI熒光染料通過流式細胞儀進行細胞DNA含量測定，會出現(xiàn)一亞二倍體細胞峰（sub-population),為DNA低染色的細胞群，其峰值低于正常G0/G1區(qū)域。DNA染色能力降低主要是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及低分子量DNA流失。第75頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞DNA含量的檢測用于檢測DNA含量的特異性熒光染料包括PI、EB、7-AAD、HO33342、DAPI等。凋亡細胞DNA信號代表核基質(zhì)上黏附著剩余核小體，交聯(lián)固定劑如甲醛能阻止凋亡細胞DNA外漏，因此不應使用。第76頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡細胞DNA含量的檢測

DNA特異性熒光染料可與其他熒光單克隆抗體同時應用，而且可通過使用溫和的乙醇固定方法同時進行DNA和免疫表型分析，雖然不是很特異，但快速、操作簡單。第77頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡蛋白含量的檢測凋亡細胞蛋白含量也會下降，其與DNA含量減少同時發(fā)生。凋亡過程中的蛋白水解是DNA降解所必需的。細胞蛋白的濃度可用不同的酸性染料如異硫氰酸熒光素（FITC）測定，它主要與氨基基團結(jié)合，很少與碳水化合物及脂質(zhì)反應。第78頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡膜磷脂重分布的檢測細胞發(fā)生凋亡時，細胞膜的結(jié)構發(fā)生變化較早，主要表現(xiàn)為細胞膜內(nèi)外不同的磷脂基團重分布。在正?；罴毎麪顟B(tài)下，細胞膜維持兩側(cè)的磷脂不對稱分布，細胞外膜PS完全缺如。這一穩(wěn)定狀態(tài)主要是由于細胞主動把外膜PS轉(zhuǎn)運到內(nèi)膜。第79頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡膜磷脂重分布的檢測在特定條件下，細胞發(fā)生凋亡時，這一不對稱性被破壞，導致外膜持續(xù)出現(xiàn)PS。這一過程首先在受體激活的血小板和老化的紅細胞中被發(fā)現(xiàn)。在受體激活或衰老時，細胞膜上PS轉(zhuǎn)運活性受抑，使PS出現(xiàn)在血小板和紅細胞外膜上。第80頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡膜磷脂重分布的檢測

Fadok等首先提出有核細胞凋亡時有PS外翻，與血小板和紅細胞有相似之處。Fadok等的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了凋亡中AnnexinⅤ作用的研究，這主要是由于在Ca2+存在時，AnnexinⅤ特異性的結(jié)合磷脂膜上的PS。因此，AnnexinⅤ能用于區(qū)別PS暴露和未暴露的血細胞和其他有核細胞。第81頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡膜磷脂重分布的檢測由于AnnexinⅤ具有區(qū)別凋亡及壞死細胞的能力，使用結(jié)合FITC的AnnexinⅤ和PI，能區(qū)分活細胞、凋亡細胞和繼發(fā)壞死細胞。PS外翻是絕大多數(shù)細胞發(fā)生凋亡的特異現(xiàn)象，而且不依賴于刺激因子。第82頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡膜磷脂重分布的檢測

AnnexinⅤ-FITC與PS外翻的細胞迅速結(jié)合，無需長時間孵育和洗滌就可以用流式細胞儀分析?；罴毎槐籄nnexinⅤ和PI染色，膜未受損害凋亡細胞僅被AnnexinⅤ染色，繼發(fā)的壞死細胞和晚期凋亡細胞被AnnexinⅤ和PI雙染色。第83頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡凋亡相關蛋白的檢測在細胞凋亡的研究中，要重視對凋亡相關蛋白的檢測，它們在特定的信號傳導通路中與啟動凋亡的信號分子相互作用。從凋亡的開始到結(jié)束，許多信號傳導通路都需要或受到特定的蛋白間相互作用的調(diào)控。第84頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡凋亡相關蛋白的檢測我們現(xiàn)在所認識的P53、bcl-2、Fas等調(diào)控凋亡的基因蛋白，均有相應的商品化單克隆抗體產(chǎn)品，從而可以應用FCM快速、方便的檢測，這也是目前流行的凋亡檢測方法。第85頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法隨著FCM的發(fā)展和越來越多的熒光探針的出現(xiàn)，應用流式細胞儀檢測凋亡細胞已成為細胞凋亡研究的常用方法。該方法可充分發(fā)揮FCM快速、靈敏、準確的特點，在完整細胞的基礎上，直接分析DNA含量的變化，并可同時對細胞表型和調(diào)控蛋白進行測定。第86頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法

PI染液的配置（100ml）：PI5mg、RNase2mg、1％TritonX-100、生理鹽水65ml、枸櫞酸鈉100mg，加蒸餾水至100ml，調(diào)pH至7.2-7.6,用棕色瓶分裝，4℃避光保存。第87頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法制備單細胞懸液，計數(shù)細胞，細胞為1×106個。假如適量生理鹽水，1000rpm，離心5min，去上清，加入預冷的70％乙醇，4℃過夜。第88頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法離心除去固定液，適量生理鹽水重懸細胞，采用篩網(wǎng)過濾一次，離心棄去上清，加入1mlPI染液，4℃避光孵育30min。第89頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法

PI用488nm的氬離子激光器激發(fā)，由630nm的帶通濾光片接收，通過FSC/SSC散點圖收集10000個細胞，采用設門技術排除粘連細胞和細胞碎片，分析PI熒光直方圖上細胞各周期的百分率和凋亡細胞百分率。第90頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法在FSC/SSC散點圖上凋亡細胞與正常細胞相比，F(xiàn)SC較小。在PI熒光直方圖上，凋亡細胞在G0/G1期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。采用雞紅細胞作為內(nèi)參對照，參入量為單細胞懸液的10％，雞紅細胞的PI熒光強度為正常二倍體細胞的35％。第91頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法

第92頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法注意事項：①單細胞懸液的細胞數(shù)量要充足，過少的細胞數(shù)會影響PI直方圖上各時相的變異系數(shù)（CV），當G0/G1期的CV＞10％時，結(jié)果的可信度下降。第93頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法注意事項：②70％的乙醇固定效果最佳，甲醛或多聚甲醛均會影響亞二倍體的出現(xiàn)。③4℃或-20℃固定效果比37℃好。④固定過程中要充分混勻細胞，避免細胞團塊形成。第94頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細胞分析細胞凋亡常用的細胞凋亡檢測方法1PI單染色法

PI單染色法的最大優(yōu)點在于獲得凋亡細胞百分數(shù)的同時，可以與細胞周期中其他時相的細胞進行比較。方法簡便、標本制備容易，檢測費用低，是目前最經(jīng)典也是最常用的細胞凋亡檢測方法。第95頁,共106頁，2024年2月25日，星期天流式細