重組基因的導(dǎo)入和鑒定

重組基因的導(dǎo)入和鑒定

構(gòu)建重組體DNA是分子生物學(xué)常用技術(shù)。它把經(jīng)過處理的、具有匹配末端的外源片段和載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后,經(jīng)生長、篩選或鑒定,獲得含目的DNA的轉(zhuǎn)化菌。本章討論外源重組基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法，及其重組子的鑒定。第2頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

第一節(jié)基因轉(zhuǎn)移的方法在確定染色體DNA是遺傳的主要載體后的一段較長時間內(nèi)，人們一直認(rèn)為雖然生物種類繁多，表型各異，但決定每種生物基因組的DNA是固定的，包括數(shù)目固定、位置固定、功能固定的一系列基因。他們的流動性受到十分嚴(yán)格的限制。第3頁,共71頁，2024年2月25日，星期天隨著遺傳學(xué)研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座等現(xiàn)象，在這些事件中存在明顯的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移，而這種轉(zhuǎn)移與生物繁殖過程中的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移有顯著區(qū)別。這些現(xiàn)象后來成為基因工程的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)?？梢杂糜诩?xì)菌、真菌和動、植物的基因工程體構(gòu)建。第4頁,共71頁，2024年2月25日，星期天一、基因轉(zhuǎn)移的物理方法

裸DNA直接注射微粒轟擊電穿孔顯微注射物理方法第5頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(1)裸DNA直接注射1990年Wolff等首次注意到給小鼠直接肌肉注射純化的DNA或RNA重組表達(dá)載體，可使載體上的基因在局部肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這種表達(dá)可持續(xù)數(shù)日或更長時間，且沒有檢出注射的外源核酸與宿主染色體整合。隨后的大量動物實驗都說明在合適的條件下，DNA接種后可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細(xì)胞及體液免疫。于是，作為一種新的基因治療手段——核酸免疫技術(shù)應(yīng)運而生。第6頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共71頁，2024年2月25日，星期天提高轉(zhuǎn)化效率措施實驗表明，橫紋肌細(xì)胞(如心肌、骨傍肌)和胸腺濾泡細(xì)胞攝取DNA的能力較強，但實際上質(zhì)粒DNA注射入肌組織后，最多只有1％-2％的肌纖維被轉(zhuǎn)染，DNA的轉(zhuǎn)染效率不僅與質(zhì)粒DNA的大小、構(gòu)型有關(guān)，還與肌細(xì)胞的狀態(tài)有十分密切的關(guān)系。人們?yōu)樘岣呒〖?xì)胞攝取DNA的能力采取了一些措施，如在質(zhì)粒接種前先給予高滲蔗糖溶液、心肌毒柬或麻醉劑(如利多卡因)的預(yù)處理。第10頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(2)基因槍介導(dǎo)的皮內(nèi)或皮下導(dǎo)入首先利用微小的金、鎢等金屬顆粒相DNA吸附，然后在高壓作用下將DNA伴隨金顆粒高速進(jìn)入細(xì)胞，由于微粒的直徑一般在0.5-0.9Fm之間，遠(yuǎn)小于細(xì)胞．因此可直接將DNA導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中，這種方法能有效地使DNA在活體組織、貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞中表達(dá)。由于該方法的高轉(zhuǎn)染效率，通常只得少量DNA即可獲得外源基因的表達(dá)并激發(fā)有效免疫應(yīng)答。第11頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

80年代末期，由康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。(2)基因槍介導(dǎo)的皮內(nèi)或皮下導(dǎo)入第12頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(2)基因槍介導(dǎo)的皮內(nèi)或皮下導(dǎo)入首先將鎢、金微粒(直徑約0.4μm，重量約0.05mg)與供體DNA溶液(1～2μl)混合并保溫，使DNA吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的“基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細(xì)胞，細(xì)胞擊穿成孔后，在鎢粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以進(jìn)入受體細(xì)胞。操作技術(shù)程序為：第13頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共71頁，2024年2月25日，星期天基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟(jì)實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細(xì)胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類以高壓蒸汽作為動力?；驑尫ǖ奶攸c：（1）轉(zhuǎn)化效率高。（2）受體廣泛。（3）操作簡單。第16頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(3)電穿孔(electroperation)

該方法利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜上形成納米大小的微孔，可將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。該方法簡便，且有較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率，可廣泛運用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移.第17頁,共71頁，2024年2月25日，星期天原理：細(xì)胞生物學(xué)研究證明，細(xì)胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，其靜膜電位（Vm）約為l00mV，導(dǎo)電性很差。當(dāng)把細(xì)胞置于外加電場中時，會使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細(xì)胞膜被壓縮變薄，當(dāng)膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿?？赡鎿舸簱舸┬】卓稍谝欢〞r間內(nèi)復(fù)原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復(fù)，處理細(xì)胞成活率低。第18頁,共71頁，2024年2月25日，星期天操作程序：將盛有細(xì)胞和DNA混合物的特制小容器置于電脈沖儀的正負(fù)極之間，在0度下加高壓（2～4KV），電脈沖10分鐘后，將待處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中生長2天，再進(jìn)行篩選。存活細(xì)胞的回收率約為60%～80%。第19頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(4)顯微注射指在顯微鏡下，將DNA由細(xì)胞玻璃針直接注入細(xì)胞?？梢詫NA直接注入核內(nèi)而減少溶酶體對外源DNA的降解，有助于基因的整合與表達(dá)。適用于多種貼壁生長細(xì)胞及懸浮生長細(xì)胞，包括原代及傳代細(xì)胞、胚胎細(xì)胞等。第20頁,共71頁，2024年2月25日，星期天微量注射：用注射針或微針在受體細(xì)胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進(jìn)入細(xì)胞或隨穿刺針頭—道進(jìn)入。真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。(4)顯微注射第21頁,共71頁，2024年2月25日，星期天固定細(xì)胞技術(shù)顯微注射技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的固定。首先必須建立固定細(xì)胞技術(shù)，然后才能進(jìn)行定位顯微注射操作。常用的細(xì)胞固定方法有3種：一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法第22頁,共71頁，2024年2月25日，星期天二、基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法化學(xué)方法磷酸鈣共沉淀法DEAE—葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法第23頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(1)磷酸鈣共沉淀法當(dāng)CaCl2、DNA和磷酸鹽緩沖液緩慢混合時，即有磷酸鈣微細(xì)沉淀形成，這些細(xì)小顆?？梢晕皆诩?xì)胞表面，通過細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用將DNA吸收進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)面后進(jìn)入細(xì)胞核，其詳細(xì)機制尚不明確。DNA多以多拷貝首尾相連的串珠狀排列進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞中常以多拷貝形式存在。第24頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共71頁，2024年2月25日，星期天該方法操作簡單，又不需特殊儀器，瞬間轉(zhuǎn)移效率最高可達(dá)到20％，但長期表達(dá)效率較低，目前已被廣泛運用于離體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，是最普遍使用的方法之一。第26頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(2)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖是一種高分子量的多聚陰離子試劑，能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源DNA，因此被用于基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。其促進(jìn)細(xì)胞捕獲DNA的機制還不清楚，可能是因為葡聚糖與DNA形成復(fù)合物而抑制了核酸酶對DNA的作用，也可能是葡聚糖與細(xì)胞結(jié)合面引發(fā)了細(xì)胞的內(nèi)吞作用。該方法可廣泛用于轉(zhuǎn)染病毒、病毒序列及其他DNA，適合于細(xì)胞瞬間表達(dá)檢測及小量DNA的轉(zhuǎn)染。第27頁,共71頁，2024年2月25日，星期天(3)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將磷脂、膽固醇或其他脂類的乙醚溶液加入到DNA溶液中，經(jīng)特殊處理得到單層或雙層的帶DNA的脂質(zhì)體小泡，通過與細(xì)胞膜融合，被細(xì)胞內(nèi)吞而實施基因轉(zhuǎn)移。這類方法基因轉(zhuǎn)移效率很高，據(jù)報道最高時，100％離體細(xì)胞可以瞬時表達(dá)外源基因。第28頁,共71頁，2024年2月25日，星期天三、基因轉(zhuǎn)移的生物方法(一）載體介導(dǎo)質(zhì)粒Ti質(zhì)粒--土壤根瘤菌Ri質(zhì)粒--發(fā)根土壤根菌逆轉(zhuǎn)錄病毒(Rv)載體腺病毒(Ad)載體腺相關(guān)病毒(AAv)載體單純皰疹病毒(HSv)載體嵌合病毒載體病毒第29頁,共71頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒兩種病原土壤桿菌根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根土壤根菌(Agrobacteriumrhizogenes)分別含有Ti和Ri質(zhì)粒為基因克隆載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。第30頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1、共培養(yǎng)法(cocultivation)Marton等1979年以原生質(zhì)體為受體建立，隨后經(jīng)過一系列的改進(jìn)，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉(zhuǎn)化方法。主要原理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接觸感染而發(fā)生轉(zhuǎn)移，供體常用農(nóng)桿菌、病毒載體等形式。（一）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法第32頁,共71頁，2024年2月25日，星期天（1）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法

取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。1、共培養(yǎng)法(cocultivation)第33頁,共71頁，2024年2月25日，星期天①從煙草無菌苗中分離原生質(zhì)體，并預(yù)培養(yǎng)24小時。②原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，原生質(zhì)體濃度l05／ml、農(nóng)桿菌l07／ml，20℃下保溫32小時。③沖洗去游離的細(xì)菌，將原生質(zhì)體培養(yǎng)在有抗生素(250mg／L萬古霉素，200mg／L羧芐青霉素，200mg／L鏈霉素)的培養(yǎng)基中，這些抗生素抑制細(xì)菌生長，而對原生質(zhì)體無毒害。④3周后，離心收集細(xì)胞團(tuán)，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，2周內(nèi)，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)是激素非依賴性生長細(xì)胞團(tuán)，在該培養(yǎng)基中可快速生長，而非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)則生長很慢，最后變褐死亡。煙草原生質(zhì)體與Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的共培養(yǎng)法程序為：第34頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共71頁，2024年2月25日，星期天（2）葉盤共培養(yǎng)法

該方法最早由Horsch(1985)首創(chuàng)，用于煙草轉(zhuǎn)化。優(yōu)點：適用性廣，對于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。第36頁,共71頁，2024年2月25日，星期天（3）懸浮細(xì)胞或愈傷組織共培養(yǎng)

原則上，該種共培養(yǎng)與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法和步驟是相同的，在供體上，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，如帶有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。

第37頁,共71頁，2024年2月25日，星期天所謂整體植株接種轉(zhuǎn)化法，是指人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植物體內(nèi)，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植物體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。接種后2-3周，切下接種處部分組織培養(yǎng)4周，可產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)基因植株。（4）活體接種(inoculationinvivo)

第38頁,共71頁，2024年2月25日，星期天2、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

（1）雙鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體這類病毒是以雙鏈DNA作為遺傳物質(zhì)，在這類病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花葉病毒（簡稱CaMV,CaullinusMozicVirus）。

（2）單鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體GeNV顧名思義，可翻譯成“雙聯(lián)體病毒”或“孿生病毒”。GeNV的感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉植物，它們的傳播媒介是昆蟲。（3）單鏈RNA病毒轉(zhuǎn)化載體迄今為止，還沒有建立起一個完善的以植物RNA病毒為基因載體的基因轉(zhuǎn)化體系，但是RNA病毒仍是一個很有希望作為基因工程載體的植物病毒。

第39頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3花粉管通道在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。該方法于80年代初期由我國學(xué)者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

第40頁,共71頁，2024年2月25日，星期天4葉綠體基因組轉(zhuǎn)化1990年Svab等利用基因槍轟擊法獲得煙草葉綠體轉(zhuǎn)基因植株。葉綠體基因組轉(zhuǎn)化技術(shù)在外源基因的導(dǎo)入,外源基因的整合與表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株的篩選等方面都取得了長足的發(fā)展。到目前為止,葉綠體基因組轉(zhuǎn)化技術(shù)已在煙草、擬南芥、馬鈴薯、油菜、番茄和水稻等高等植物中獲得了成功。第41頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)重組體的篩選與鑒定一、遺傳檢測法二、物理檢測法

三、菌落或噬菌斑雜交篩選法四、免疫化學(xué)檢測法五、DNA-蛋白質(zhì)篩選法六、轉(zhuǎn)譯篩選法第42頁,共71頁，2024年2月25日，星期天一、遺傳檢測法1、根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子

質(zhì)粒、柯斯載體--抗藥性記號或營養(yǎng)記號噬菌體--噬菌斑

第43頁,共71頁，2024年2月25日，星期天pBR322質(zhì)粒--四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨卞青霉素抗性基因(ampr)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)在含有四環(huán)素或氨卞青霉素的生長培養(yǎng)基中,檢測出獲得了此種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。第44頁,共71頁，2024年2月25日，星期天插入失活效應(yīng)(Insertionalinactivation)檢測外源DNA插入的方法在pBR322質(zhì)粒的DNA序列上有許多種不同的核酸內(nèi)切限制的識別為位點都可以接受外源DNA的插入。如攜帶在amprtetr基因的pBR322質(zhì)粒,當(dāng)其tetr基因中插人外源DNA片段時，其宿主細(xì)胞表型變?yōu)閍mprtets,可以通過這種方法篩選出重組體分子。第45頁,共71頁，2024年2月25日，星期天插入失活法篩選重組子第46頁,共71頁，2024年2月25日，星期天半乳糖苷酶顯色反應(yīng)pUC18質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補作用。因此，在應(yīng)用pUC18質(zhì)粒為載體的重組實驗中，可用X-gal顯色法一步實現(xiàn)對重組子克隆的鑒定。第47頁,共71頁，2024年2月25日，星期天lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大腸桿菌完整的β-半乳糖苷酶第48頁,共71頁，2024年2月25日，星期天重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’

的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第49頁,共71頁，2024年2月25日，星期天互補顯色反應(yīng)

第50頁,共71頁，2024年2月25日，星期天2根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法外源基因能夠表達(dá)，可以根據(jù)表型特征的直接選擇?；驹恚恨D(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。第51頁,共71頁，2024年2月25日，星期天例如，編碼大腸桿菌生物合成基因克隆的外源DNA片段，對于大腸桿菌寄主菌株不可逆的營養(yǎng)缺陷突變具有互補的功能。根據(jù)這種特性，我們便可以分離到獲得了這種基因的重組體克隆。目前已擁有相當(dāng)數(shù)量的對其突變作了詳盡研究的大腸桿菌實用菌株。而且其中有許多種類型的突變，只要克隆的外源基因產(chǎn)物獲得低水平的表達(dá)，便會破抑制或發(fā)生互補作用。應(yīng)用類似的方法成功地分離了小鼠的二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因。第52頁,共71頁，2024年2月25日，星期天這種篩選法受一定的條件限制，它不單要求克隆的DNA片段必須大到足以包含一個完整的基因序列，而且還要求所編碼的基因應(yīng)能夠在大腸桿菌寄主細(xì)胞中實現(xiàn)功能表達(dá)。無疑，真核基因是難以滿足這些要求的。其原因在于有許多真核基因是不能同大腸桿菌的突變發(fā)生抑制作用或互補效應(yīng)的。此外，大多數(shù)的真核基因內(nèi)部都存在著間隔序列，而大腸桿菌又不存在真核基因轉(zhuǎn)錄加工過程中所需要的剪輯機理，這樣便阻礙了它們在大腸桿菌寄主細(xì)胞中實現(xiàn)基因產(chǎn)物的表達(dá)，當(dāng)然，在有些情況下可以通過使用mRNA的cDNA拷貝構(gòu)建重組體DNA的辦法，來克服這類問題。第53頁,共71頁，2024年2月25日，星期天在利用λ噬菌體載體篩選重組體時，主要依賴重組DNA的大小及形成噬菌斑的能力，只有當(dāng)重組體DNA是野生型λDNA的75％-l05％的長度時，才能在培養(yǎng)平板上形成“清晰的噬菌斑”，而單一載體DNA是不會包裝成活的噬菌體顆粒的。經(jīng)體外包裝及轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰的噬菌斑，尤其是對替換型λ噬菌體載體，本身就是一種可利用的選擇標(biāo)記。第54頁,共71頁，2024年2月25日，星期天二、物理檢測法

1凝膠電泳檢測法證明重組體質(zhì)粒在分子量上的增加,一種直截了當(dāng)?shù)姆椒ㄊ欠蛛x質(zhì)粒的DNA并測定其分子長度。對此。電子顯微鏡測定無疑是有效的方法，但對于以篩選為目的實驗來說,則顯得過于煩瑣。因此,常用操作程序比較簡單的凝膠電泳測定法來代替。第55頁,共71頁，2024年2月25日，星期天帶有外源DNA插入序列、分子量較大的重組體DNA在凝膠中的遷移速率，比不具有外源DNA插入序列、分子量較小的質(zhì)粒DNA來得緩慢些。根據(jù)這種差別就可以容易地鑒定出哪些菌落是含有外源DNA插入序列的分子量較大的重組質(zhì)粒。第56頁,共71頁，2024年2月25日，星期天物理檢測法

凝膠電泳檢測法第57頁,共71頁，2024年2月25日，星期天2R環(huán)檢測法采用mRNA作探針的核酸雜交法，來檢測具有外源DNA插入片段的重組體分子。一種是R-環(huán)檢測法，另一種是放射性探針檢測法。第58頁,共71頁，2024年2月25日，星期天在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度(70％)的甲酰胺溶液中,雙鏈的DNA-RNA分子穩(wěn)定。第59頁,共71頁，2024年2月25日，星期天這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體,叫做R-環(huán)結(jié)構(gòu)?？梢栽陔娮语@微鏡下觀察到?？梢澡b定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。使待檢測純化的質(zhì)粒DNA，在含mRNA分子的緩沖液中局部的變性。如果質(zhì)粒DNA分子上存在著與mRNA探針互補的序列，那么這種mRNA就將取代DNA分子中的相應(yīng)的互補鏈，形成R-環(huán)結(jié)構(gòu)。然后放置在電子顯微鏡下觀察,這樣使可以檢測出重組體質(zhì)粒的DNA分子第60頁,共71頁，2024年2月25日，星期天三、菌落或噬菌斑雜交篩選法核酸雜交檢測法：應(yīng)用放射性標(biāo)記的特定的DNA或RNA作探針，進(jìn)行DNA/DNA或DNA／RNA雜交。最早由M.Grunstein和D.Hogness(1975)發(fā)明應(yīng)用放射性標(biāo)記的探針原位篩選重組體菌落的方法。經(jīng)過D.Hanahan和M.Meselson(1980)的改良可適用于高密度的菌落雜交篩選。第61頁,共71頁，2024年2月25日，星期天菌落原位雜交是先將要篩選的菌落影印到平板表面的硝酸纖維素濾膜上，繼續(xù)培養(yǎng)至生長出菌落，取出長有菌落的濾膜，用堿處理裂解菌體，再將膜用蛋白酶K處理以除去蛋白質(zhì)。在80℃烘烤膜以固定DNA，最后用探針進(jìn)行雜交，并參照放射自顯影底片上的曝光點，從平板上的相應(yīng)位置挑出陽性菌落。第62頁,共71頁，2024年2月25日，星期天例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬