宏基因組學(xué)的研究

宏基因組學(xué)研究進(jìn)展及其應(yīng)用摘要：本文先簡(jiǎn)要介紹了當(dāng)前生物化學(xué)的一些研究熱點(diǎn)，再針對(duì)宏基因組學(xué)展開(kāi)論述，介紹了宏基因組學(xué)的產(chǎn)生背景和概念，當(dāng)前的研究進(jìn)展及應(yīng)用。宏基因組學(xué)嘗試通過(guò)免培方法獲得微生物的純培養(yǎng)，主要技術(shù)包括DNA的提取、文庫(kù)的構(gòu)建和目標(biāo)基因克隆的篩選，可用于開(kāi)發(fā)新型酶、發(fā)現(xiàn)新基因、篩選醫(yī)藥等方面。關(guān)鍵字：宏基因組學(xué)；宏基因組學(xué)基本策略；文庫(kù)構(gòu)建與篩選；宏基因組學(xué)研究進(jìn)展及其應(yīng)用引言：微生物是地球上種類最多、數(shù)量最大、分布最廣的生物群。僅原核生物(細(xì)菌和古細(xì)菌)即構(gòu)成地球生物總量的的25～50%[1]。自然條件下，包括病毒在內(nèi)的微生物,通過(guò)群落廣泛參與C、N、O和S等重要元素的循環(huán)轉(zhuǎn)化，在人體的食物消化、毒素降解及機(jī)體免疫反應(yīng)，環(huán)境污染物降解等方面發(fā)揮著重要作用[2]。人們對(duì)于微生物的研究主要是建立在純培養(yǎng)基礎(chǔ)上，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)純培養(yǎng)方法估計(jì)的環(huán)境微生物多樣性只占總量的0.1%~1%[3]，多達(dá)99%以上的微生物是不可培養(yǎng)的,其中蘊(yùn)含著巨大的應(yīng)用潛能——其代謝產(chǎn)物中可能有眾多具有應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值的化合物[4]。為了研究不能培養(yǎng)的微生物，一個(gè)全新的理念——宏基因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)不需預(yù)先培養(yǎng)就能開(kāi)發(fā)這些微生物基因組，目前已廣泛應(yīng)用于微生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用、環(huán)境微生物種群分布及動(dòng)態(tài)變化分析等方面的研究[5]。宏基因組學(xué)的提出為解決上述問(wèn)題提供了一個(gè)可行途徑。宏基因組學(xué)以生境中全部DNA作為研究對(duì)象，通過(guò)克隆、異源表達(dá)來(lái)篩選有用基因及其產(chǎn)物。由于突破了傳統(tǒng)研究領(lǐng)域無(wú)法涵蓋不可培養(yǎng)微生物的瓶頸，宏基因組學(xué)概念及研究方法一經(jīng)提出，就被廣泛接受。盡管在方法上還存在一定缺陷，但并不妨礙不同領(lǐng)域?qū)W者利用該方法來(lái)研究各種生境中微生物生態(tài)以及篩選功能基因的熱情，有關(guān)宏基因組學(xué)研究的文章逐年增多[4]。宏基因組學(xué)的概念宏基因組(metagenome)的概念是指從生境樣本中取得全部微生物的基因組,而不是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)微生物的基因組。宏基因組的樣本既包括可培養(yǎng)的微生物，也包括更大量的傳統(tǒng)方法無(wú)法研究的不可培養(yǎng)微生物[6]。而所謂宏基因組學(xué)(也稱元基因組學(xué)Metagenomics、微生物環(huán)境基因組學(xué)MicrobialEnvironmentalGenomics、生態(tài)基因組學(xué)Ecogenomics)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、構(gòu)建文庫(kù)和功能分析篩選等工作[7]。宏基因組學(xué)的基本策略及方法2.1宏基因組學(xué)的基本策略宏基因組學(xué)的研究還處于初期發(fā)展階段，但其研究的基本過(guò)程和基本策略已基本清楚。在此要強(qiáng)調(diào)的是，宏基因組學(xué)研究有著明確的指導(dǎo)思想，它是在反向生物學(xué)原則指導(dǎo)下，基于特定生態(tài)環(huán)境基礎(chǔ)上，依據(jù)整體、系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)變化和相互作用的觀點(diǎn)，運(yùn)用特殊的技術(shù)路線和方法，對(duì)研究范圍中所有基因組展開(kāi)研究的學(xué)科。
宏基因組學(xué)是一種整體性的研究策略，它建立在微生物基因組學(xué)的迅速發(fā)展和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)之上，是一種不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)，涵蓋了生物信息統(tǒng)計(jì)分析和基因組兩方面的意義和技術(shù)，其策略是從特定環(huán)境中直接分離所有微生物DNA，將大片段的DNA克隆到受體菌中表達(dá)，然后根據(jù)某些生物活性篩選有應(yīng)用價(jià)值的克隆。[8]2.2宏基因組學(xué)研究的基本方法宏基因組學(xué)以基因組技術(shù)為基礎(chǔ)，基本程序包括：環(huán)境樣品中宏基因組的提取，將DNA克隆到載體中;載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌建立環(huán)境基因組文庫(kù)，環(huán)境基因組文庫(kù)分析和篩選。近年來(lái)，隨著新一代高通量、低成本測(cè)序儀的問(wèn)世，宏基因組的研究可對(duì)特定生境中的基因組片段直接進(jìn)行測(cè)序而不用構(gòu)建文庫(kù)，從而避免了在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中利用細(xì)菌對(duì)樣品進(jìn)行克隆以及克隆中引起的偏差，簡(jiǎn)化了宏基因組研究的基本操作，提高了測(cè)序效率，極大地促進(jìn)了宏基因組學(xué)發(fā)展[9]。2.2.1宏基因組DNA的提取環(huán)境樣品DNA的提取是文庫(kù)構(gòu)建中最重要、最關(guān)鍵的一步，不僅要盡可能地將環(huán)境中所有微生物的DNA提取出來(lái)，還要保證一定的DNA片段長(zhǎng)度和完整性。另外，環(huán)境樣品中都含有一定的雜質(zhì)(如土壤中的腐殖酸類物質(zhì))，這些物質(zhì)可抑制分子克隆中多種酶的活性，因此必須將其除去[10]。目的樣品的采集須嚴(yán)格遵循取樣規(guī)則，使樣品能最好地代表自然狀態(tài)下的微生物狀態(tài)[9]。根據(jù)提取宏基因組前是否分離細(xì)胞，提取方法可分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法主要是通過(guò)去污劑處理(如SDS)，酶解法(如蛋白酶K)等直接破碎樣品中的微生物而使DNA得以釋放。由于無(wú)須對(duì)樣品微生物進(jìn)行復(fù)性，且黏附于顆粒上的微生物細(xì)胞亦能被裂解，原位裂解所得DNA能更好地代表樣品微生物的多樣性，且操作簡(jiǎn)單，成本低，DNA提取率高。但該法提取的DNA片段較小(1～50kb)，通常適用于構(gòu)建小片段文庫(kù)的DNA提取[11]。異位裂解法先用物理方法將微生物從樣品中分離出來(lái)，然后采用較溫和的方法抽提DNA，可獲得純度較高的大片段DNA(20～500kb)，但該法操作繁瑣，一些微生物基因組在分離過(guò)程中可能丟失，溫和條件下一些細(xì)胞壁較厚的微生物DNA抽提不出來(lái)，提取率較低且成本高，通常適用于構(gòu)建大片段插入文庫(kù)的DNA提取[12]。2.2.2宏基因組文庫(kù)構(gòu)建與篩選宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建沿用了分子克隆的基本原理和技術(shù)方法，并根據(jù)具體環(huán)境樣品的特點(diǎn)和建庫(kù)目的采取了一些特殊的步驟和策略。構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的技術(shù)主要包括：提取和純化環(huán)境微生物DNA、選取合適的克隆載體以及選擇宿主菌株。基本原則是以分離獨(dú)立基因或者一些編碼新代謝功能的小操縱子為目的時(shí)，以小插入片段載體(如質(zhì)粒)構(gòu)建文庫(kù)，提取和純化DNA時(shí)只需考慮純度和物種的豐度[13]；而大插入片段文庫(kù)(如Cosmid、Fosmid或者BAC)適合于獲取編碼復(fù)雜生物合成途徑的大基因片段或者基因簇，但是構(gòu)建這種文庫(kù)需要提取和純化更高長(zhǎng)度和純度質(zhì)量要求的DNA。2.2.2.1載體選擇DNA提取后就可以構(gòu)建文庫(kù)。在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，載體是文庫(kù)構(gòu)建所必需的因素,而且在