動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞培育常用技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培育中山大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心前言1885年Roux最早嘗試使組織離體培育，材料是雞胚神經(jīng)板，承受生理鹽水為培育液，并首次承受組織培育這個(gè)術(shù)語(yǔ)。1907Harrison1912Carrel的培育。由于組織培育在醫(yī)學(xué)爭(zhēng)論中的應(yīng)用，如抗病的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)漸漸進(jìn)展成為一門精細(xì)技術(shù)。很多細(xì)胞株、細(xì)胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細(xì)胞系，如Hela細(xì)胞系〔Gey，1952，可用來進(jìn)展一系列爭(zhēng)論，更加促進(jìn)了組織培育技術(shù)的進(jìn)展。組織培育中熱門的爭(zhēng)論領(lǐng)域細(xì)胞內(nèi)部的活動(dòng)，如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝；細(xì)胞內(nèi)部的流淌，如RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)方向運(yùn)轉(zhuǎn)，激素受體復(fù)合物的易位等；生態(tài)學(xué)，如養(yǎng)分、感染、病毒或化學(xué)誘變、藥物作用；細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，如胚胎誘導(dǎo)、細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)等。組織培育的分類及根本概念分類:組織培育(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無菌、適當(dāng)溫度和肯定養(yǎng)分條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其構(gòu)造和功能的方法。細(xì)胞培育(CellCulture)培育物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。器官培育〔OrganCulture〕培育的是器官的原基、器官的一局部或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持肯定功能的方法。組織培育的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn):體內(nèi)外細(xì)胞的差異：當(dāng)人工條件和體內(nèi)實(shí)際狀況不完全一樣時(shí)，細(xì)胞在體外培育后，一旦失去神經(jīng)體液調(diào)整和細(xì)胞間相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必定。細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：返祖〔Atavism〕現(xiàn)象，即失去原有組織構(gòu)造和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。細(xì)胞增殖和分化：是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的根本屬性，增殖使細(xì)胞數(shù)量增多；分化使機(jī)體構(gòu)造和功能多樣化，最終演化成完整的有機(jī)體。培育細(xì)胞的分化細(xì)胞分化機(jī)制是極其簡(jiǎn)單的，是在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與體液和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用下，眾多基因參與、經(jīng)過多階段和多環(huán)節(jié)完成的動(dòng)態(tài)演化過程。不適應(yīng)〔Deadaption〕酸轉(zhuǎn)移酶的特性。脫分化〔去分化Dedifferentiation〕酶的特性后，儲(chǔ)存肝糖元的力量喪失，并很難再現(xiàn)。不適應(yīng)和脫分化兩個(gè)概念不同：不適應(yīng)是由于生存條件轉(zhuǎn)變而使分化發(fā)生抑制；從分子水平考慮，脫分化很可能是基因變異所致。培育細(xì)胞的形態(tài)貼附型：成纖維細(xì)胞：心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等上皮型細(xì)胞：消化管外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等游走型細(xì)胞：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多形型細(xì)胞：神經(jīng)組織細(xì)胞懸浮型：如癌細(xì)胞培育細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖原代培育〔PrimaryCulture〕階段：或稱初代培育。從體內(nèi)取出組織接種培育到第一次傳1~4w傳代培育〔Subculture〕階段：或稱繼代培育。也就是細(xì)胞系〔Cellline〕階段，細(xì)胞增10-50。衰退階段：自發(fā)性轉(zhuǎn)化SpontaneousTransformation：其標(biāo)志是獲得永生性Immortality〕〔Malignancy〕(Infinitecellline)或連續(xù)細(xì)胞系(Continuouscellline)。如：BHK〔倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞F9〔小鼠胚胎癌細(xì)胞M2R〔黑色素瘤細(xì)胞〕培育細(xì)胞的傳代培育當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到達(dá)肯定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培育液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。50代即該細(xì)胞50細(xì)胞傳代的三個(gè)階段1〕埋伏期〔Latentphase：細(xì)胞從接種到貼壁生長(zhǎng)生殖的一段時(shí)間。二倍體細(xì)胞該期時(shí)間長(zhǎng)〔24~96h；連續(xù)細(xì)胞系時(shí)間短〔10~30min。指數(shù)生長(zhǎng)期〔Logarthmicgrowthphase：細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)〔Mitoticindex，MI〕表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培育細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1~0.5%，且受細(xì)胞種類培育液成分、pH、溫度等影響。指數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜狀況下，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間日趨削減，細(xì)胞相互接觸集合成片，呈現(xiàn)接觸抑制〔Contactinhibition一。〔Densityinhibition〕停滯期〔Stagnatephase：即細(xì)胞數(shù)量到達(dá)飽和密度后，細(xì)胞與養(yǎng)分液的交換面積削減，代謝產(chǎn)物積存，PH下降細(xì)胞停頓增殖，進(jìn)入停滯期。在此時(shí)應(yīng)準(zhǔn)時(shí)進(jìn)展換液傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞消滅1-2細(xì)胞培育的根本條件儀器和設(shè)備:CO2培育器材：如培育瓶，純水設(shè)備，枯燥消毒除菌設(shè)備，清洗設(shè)備等。培育液:目前常用的根底培育液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等，可依據(jù)培育需求合理選擇。細(xì)胞培育的根本條件血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動(dòng)物血清。的爭(zhēng)論時(shí)，需要使用無血清培育基。細(xì)胞培育的根本條件平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，供給緩沖系統(tǒng)，使培育液的酸監(jiān)度維持在培育細(xì)胞生理范圍內(nèi)，供給細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機(jī)離子等。PBS，Hank’s〔50~100〔50~100。其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES〔’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid，緩沖效能(pKa)20℃7.55，37℃7.31；HEPESpHpHpHNaHCO3有機(jī)補(bǔ)充物，如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子，如生長(zhǎng)因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，EGF(表皮生長(zhǎng)因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？梢罁?jù)培育細(xì)胞的特別要求進(jìn)展添加。培育液的物理性質(zhì)pHpH7.46.8，7.6。酚紅是常用的指示劑，用來檢測(cè)PH--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。pHCO2pH。260~320mosm/kg290mosm/kg310mosm/kg。粘度：由于血清的存在，直接影響培育液粘度。外表張力：培育液的外表張力有利于培育物粘著于底物上面。細(xì)胞培育的根本方法組織、細(xì)胞的解離方法解離組織：在無菌狀況下實(shí)行動(dòng)物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺(tái)或無菌室內(nèi)進(jìn)展解離處理。解離時(shí)應(yīng)留意:盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈；剪碎組織時(shí)，避開損傷組織塊；解離組織用的各種酶系，需要先進(jìn)展低速離心。解離細(xì)胞常用酶和鰲合劑進(jìn)展解離：當(dāng)試驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培育物；從單個(gè)細(xì)胞動(dòng)身獲得細(xì)胞群體；從肯定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時(shí)。解離細(xì)胞的方法胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對(duì)解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終200u/ml，36.5℃4-48h。膠原酶和透亮質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分別大鼠或兔的肝臟組織。機(jī)械解離細(xì)胞法：比酶法所需時(shí)間短，但細(xì)胞存活率較低。螯合劑解離細(xì)胞法：分別效果差原代細(xì)胞培育外植塊培育：外植塊在肯定限度內(nèi)可保持其原有組織構(gòu)造，有利于其適應(yīng)體外培育環(huán)境。短期培育的外植塊成為細(xì)胞培育的材料來源之一。單層細(xì)胞培育：每隔1~3d換液一次，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后傳代培育。懸浮細(xì)胞培育：使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)在培育液中連續(xù)生長(zhǎng)。由于細(xì)胞本身是不粘附的，如小鼠白血病細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞；通過機(jī)械攪動(dòng)使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)；通過選擇培育得到能懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)展懸浮培育。細(xì)胞培育中應(yīng)留意的幾個(gè)問題培育液和培育物的比例：肯定濃度的培育液僅能支持肯定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。PHpH7.4，7.0。培育瓶?jī)?nèi)的空間：一般培育瓶?jī)?nèi)培育液與液面上的空間體積之比為1:10。0.2~0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培育液〔2mm〕中生長(zhǎng)較好；需要低濃度氧的。在深的培育液〔5mm〕中生長(zhǎng)較好。5〕去除死細(xì)胞6〕溫度掌握：動(dòng)物細(xì)胞培育對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；37.5℃，細(xì)胞存活力降低。細(xì)胞系及其鑒定類型也是多種多樣的。所以再培育不僅僅是為了維持細(xì)胞不斷地生長(zhǎng)，而且是使培育物逐步成為具有增殖力量、特征專一、類型均勻的培育細(xì)胞，即細(xì)胞系(Cellline)。細(xì)胞克隆技術(shù)培育細(xì)胞系可承受細(xì)胞克隆技術(shù)。一個(gè)克隆的細(xì)胞群體是從一個(gè)單一母細(xì)胞生殖而來，分別單一細(xì)胞并使其生殖為一細(xì)胞群體的方法稱為克隆化(cloning)。細(xì)胞克隆技術(shù)的方法稀釋鋪板法飼養(yǎng)層克隆法膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法瓊脂克隆法在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法細(xì)胞系鑒定當(dāng)細(xì)胞系建立后，應(yīng)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)展一系列鑒定后，才能應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的爭(zhēng)論。鑒定內(nèi)容應(yīng)包括:細(xì)胞系的細(xì)胞來源；鑒定細(xì)胞系的純度，即除了主類細(xì)胞外，還雜有哪類細(xì)胞；細(xì)胞系的穩(wěn)定性，即在細(xì)胞連續(xù)培育過程中主要指標(biāo)應(yīng)無明顯變化；累積細(xì)胞系的形態(tài)及其表達(dá)特征的根本數(shù)據(jù)，以及其與來源細(xì)胞的差異等；細(xì)胞系鑒定指標(biāo)形態(tài)學(xué)：活細(xì)胞觀看；固定染色觀看培育細(xì)胞。染色體：染色體是一種鑒定細(xì)胞系的種屬、性別來源較為精準(zhǔn)的指標(biāo)；也是檢查細(xì)胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培育條件下細(xì)胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的牢靠指標(biāo)；是區(qū)分正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的指標(biāo)。承受染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術(shù)檢測(cè)。同工酶譜：通常承受G6PD(葡萄糖-6-LDH(依據(jù)條件選擇。DNA限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP)是指那些在生物進(jìn)化過程中，DNA序列發(fā)生某些中性突變，突變的結(jié)果是失去或獲得一個(gè)酶切點(diǎn)，因此當(dāng)基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，限制性內(nèi)切酶片斷加長(zhǎng)或縮短；用同源的克隆DNADNADNA列序列轉(zhuǎn)變，影響內(nèi)切酶切點(diǎn),使內(nèi)切酶酶切片斷呈多態(tài)性。Southern培育細(xì)胞的污染問題及檢測(cè)細(xì)胞培育的污染問題格外重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培育肯定要建立無菌觀念。遇到培育污染要分析緣由，準(zhǔn)時(shí)處理。細(xì)胞污染的種類和判定細(xì)胞培育中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在消滅以下狀況時(shí)培育的細(xì)胞可能有污染：培育液的酸堿度發(fā)生特別的轉(zhuǎn)變。培育液消滅混濁。光鏡觀看到菌絲和顆粒。細(xì)胞消滅死亡或增殖緩慢等。污染物的檢測(cè)細(xì)菌和真菌污染的檢測(cè)：涂片染色鏡檢；接種培育：TrypticaseBHI、Thioglycocollate菌檢測(cè)；SabouraudYM檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培育物及其用具。支原體檢測(cè):支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體轉(zhuǎn)變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培育細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的生殖影響較小而往往被無視。支原體檢測(cè)方法和處理熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，Hoechest33258依據(jù)細(xì)胞外表的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體。直接培育法：試驗(yàn)室常用。放射自顯影檢測(cè)：DNA檢測(cè)完畢后，全部試驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理。污染支原體后的處理：抗生素處理：如參加泰樂菌素等。共培育法：與巨噬細(xì)胞共培育。重克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的穎培育液，4~52過濾法：0.22μm污染病毒的檢測(cè)致細(xì)胞病變效應(yīng)〔CPE〕或集落的檢測(cè)：承受相差顯微鏡檢測(cè)血細(xì)胞吸附試驗(yàn)；雞胚接種。細(xì)胞間穿插污染為避開細(xì)胞間穿插污染，應(yīng)留意：了解各細(xì)胞系的特征；培育各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；培育各細(xì)胞系不用同一瓶的培育液和酶等；吸過培育液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲(chǔ)存培育液和酶的瓶?jī)?nèi)；常常檢查培育物特征，留意任何突然的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有穿插污染?！矎?fù)蘇。要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必需了解如下幾個(gè)問題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。1、冷凍速率冷凍速率太快或太慢都會(huì)造成細(xì)胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最正確的冷凍保存效果。不同細(xì)胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞最適冷凍速1.6℃、