RT-PCR檢測血細(xì)胞中p53基因的表達(dá)

血細(xì)胞P53基因表達(dá)檢測——RT-PCR湘雅醫(yī)檢15012021/3/29星期一1P53基因P53基因命名該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)功能作用重要的抑癌基因，防止癌變細(xì)胞基因的修復(fù)功能RT-PCRRT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù))RNA的反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。在GenBank中查找p53基因設(shè)計引物確定參數(shù)檢測p53基因在血細(xì)胞中的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄的引物五個主要問題基因表達(dá)的檢測方法2021/3/29星期一4Ques2021/3/29星期一5在蛋白質(zhì)水平基因檢測的方法在DNA水平在MRNA水平Northern印記雜交RT-PCR.......ReverseTranscriptionPCR

RNA提取cDNA反轉(zhuǎn)錄PCRNorthern印記雜交Northern印記雜交基因表達(dá)水平隨機(jī)六核苷酸引物引導(dǎo)Oligo(dT)引導(dǎo)特異性引導(dǎo)2021/3/29星期一7Ques2021/3/29星期一8反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.

反轉(zhuǎn)錄可用的引物010305

Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。

隨機(jī)六聚體引物：用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。特異性引物：用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。Ques2021/3/29星期一11查找P53序列使用GENBANK，P53登陸號AH007667查找P53序列查找P53序列查找P53序列引物設(shè)計的原則15263748引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)引物長度一般在15~30堿基之間G+C含量在40%~60%之間堿基要隨機(jī)分布引物自身及之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)引物5′端可以修飾引物3’端不可修飾引物3′端要避開密碼子的第3位Ques2021/3/29星期一17引物設(shè)計PRIMERPREMIER5.0Primer

Premier5.0是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設(shè)計、評估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計窗口（Primer

Design），酶切分析窗口（Restriction

Sites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設(shè)計功能。引物設(shè)計1啟動界面引物設(shè)計2在此輸入需擴(kuò)增的DNA序列引物設(shè)計3引物設(shè)計4引物設(shè)計5引物設(shè)計6引物設(shè)計7引物設(shè)計8Hairpin：發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer：二聚體FalsePriming：錯配CrossDimer：交叉二聚體引物設(shè)計9引物設(shè)計10引物設(shè)計11保存選擇滿意的引物引物設(shè)計12所選引物確定參數(shù)cDNAsize:434bp94度30秒變性155度45秒退火273度60秒延伸327次循環(huán)4確定參數(shù)四項參數(shù)循環(huán)次數(shù)退火延伸變性模板DNA由雙鏈變成單鏈，有利于與引物結(jié)合?？筛鶕?jù)模板的復(fù)雜程度調(diào)整變性溫度和時間，一般情況下94

C30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。變性的DNA快速冷卻至40－60

C可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合?？筛鶕?jù)引物的長度和G＋C的含量選擇復(fù)性溫度一般是70－75

C，此時TaqDNA聚合酶活性最高。<1kb，1分鐘；>1kb的可適當(dāng)延長時間。理論上20－25個循環(huán)PCR產(chǎn)物的累計即可達(dá)到最大值、實際操作中25－30較合理。確定參數(shù)退火溫度：50℃~54℃Ques2021/3/29星期一34檢測基因的表達(dá)根據(jù)產(chǎn)物長度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠，取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統(tǒng)成像分析。瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物：檢測基因的表達(dá)123