藥典無菌檢查常州培訓(xùn)

藥典無菌檢查常州培訓(xùn)2

主要內(nèi)容無菌產(chǎn)品理念無菌和無菌檢查法概念無菌操作及無菌技術(shù)要求無菌檢查法的局限性醫(yī)療器具無菌檢驗依據(jù)實驗環(huán)境條件及人員要求試驗主要設(shè)備培養(yǎng)基種類用途及配制要求培養(yǎng)基適用性檢查方法適用性試驗供試品的無菌檢查五月24第2頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1、無菌產(chǎn)品理念滅菌產(chǎn)品的無菌保證不能依賴最終產(chǎn)品的無菌檢驗，它是作為確定批無菌產(chǎn)品是否無菌的一個檢驗項目，而產(chǎn)品的無菌保證要取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、良好的無菌保證體系和嚴(yán)格的GMP管理。五月243第3頁,共53頁，2024年2月25日，星期天4

無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無菌檢查法：用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。2、無菌和無菌檢查法概念五月24第4頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3、無菌操作及無菌技術(shù)要求無菌操作

是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械等進(jìn)行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。無菌技術(shù)是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其他干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，無菌試驗器材及無菌操作。五月245第5頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

4、無菌檢查法的局限性若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試

品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。五月246第6頁,共53頁，2024年2月25日，星期天7

5、醫(yī)療器具無菌檢驗依據(jù)本規(guī)范選用于《中國藥典》2015年版四部1101無菌檢查法。GB/T14233.2-2005《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法，第二部分：生物試驗方法中規(guī)定的無菌試驗方法。五月24第7頁,共53頁，2024年2月25日，星期天8

6、實驗環(huán)境條件要求

2015藥典無菌檢查：應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，試驗環(huán)境必須達(dá)到無菌檢查的要求，檢驗全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。五月24第8頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

6.1實驗環(huán)境潔凈度要求（修改）五月249第9頁,共53頁，2024年2月25日，星期天10

6.2實驗環(huán)境人員要求：

菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)培訓(xùn)。五月24第10頁,共53頁，2024年2月25日，星期天117

、試驗主要設(shè)備細(xì)菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱超凈工作臺可調(diào)溫的培養(yǎng)箱顯微鏡臺式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器電熱恒溫干燥箱集菌儀五月24第11頁,共53頁，2024年2月25日，星期天12

試驗儀器（1）-超凈工作臺五月24第12頁,共53頁，2024年2月25日，星期天13

試驗設(shè)備（2）--隔水式恒溫培養(yǎng)箱五月24第13頁,共53頁，2024年2月25日，星期天14

試驗設(shè)備（3）----霉菌培養(yǎng)箱五月24第14頁,共53頁，2024年2月25日，星期天15試驗設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器五月24第15頁,共53頁，2024年2月25日，星期天16試驗設(shè)備（5）--臺式蒸汽滅菌器五月24第16頁,共53頁，2024年2月25日，星期天17試驗設(shè)備（6）--顯微鏡五月24第17頁,共53頁，2024年2月25日，星期天18試驗設(shè)備（7）-生物安全柜五月24第18頁,共53頁，2024年2月25日，星期天19試驗設(shè)備（8）Equinox全自動無菌檢驗系統(tǒng)五月24第19頁,共53頁，2024年2月25日，星期天208、培養(yǎng)基種類及用途

硫乙醇酸鹽流體基（主要用于厭氣菌培養(yǎng)、也可用于需氧菌培養(yǎng)）胰酪大豆胨液體基（用于真菌和需氧菌培養(yǎng)）五月24第20頁,共53頁，2024年2月25日，星期天218.1培養(yǎng)基配制及要求培養(yǎng)基的滅菌：配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。保存時間：制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：2～25℃、避光環(huán)境。非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用；密閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用。五月24第21頁,共53頁，2024年2月25日，星期天228.2培養(yǎng)基配制及要求硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：配制后調(diào)節(jié)PH值為弱堿性，使滅菌后在25℃的pH為7.1±0.2，分裝在適宜的容器中，其裝量與容器高度的比列應(yīng)符合培養(yǎng)后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層（粉紅色）的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1／5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：置30～35℃培養(yǎng)。五月24第22頁,共53頁，2024年2月25日，星期天238.3培養(yǎng)基配制及要求

胰酪大豆胨液體基：取培養(yǎng)基成分混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)PH值約為7.3±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。胰酪大豆胨液體基：置20～25℃培養(yǎng)。五月24第23頁,共53頁，2024年2月25日，星期天248.4培養(yǎng)基配制及要求

培養(yǎng)基裝量：對于采用直接接種法檢查的供試品，應(yīng)根據(jù)供試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不大于培養(yǎng)基體積的10%。供試品檢查時，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗。五月24第24頁,共53頁，2024年2月25日，星期天25

9、培養(yǎng)基適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌檢查及靈敏度檢查的要求。無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），置培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。靈敏度檢查：用于培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為0代），采用適宜的方法保存；并以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。五月24第25頁,共53頁，2024年2月25日，星期天269.1培養(yǎng)基適用性檢查菌種：試驗用菌株及菌液制備：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003銅綠色假單胞菌[CMCC(B)10104]枯草桿菌[CMCC(B)63501]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]

五月24第26頁,共53頁，2024年2月25日，星期天27五月24注：10倍梯度稀釋；選擇適宜的3個稀釋級別；要求＜100cfu/ml。第27頁,共53頁，2024年2月25日，星期天289.2

培養(yǎng)基適用性檢查

菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48h，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu孢子懸液；（如表9.3）注：菌懸液在室溫下2h使用,若保存在2～8℃可在24小時內(nèi)使用。五月24第28頁,共53頁，2024年2月25日，星期天29

9.3培養(yǎng)基靈敏度檢查

菌種

接種培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度℃培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體基或胰酪大豆胨瓊脂基上30～35

18～24h銅綠假單孢菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上20～2524～48h黑曲霉新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上20～255～7d五月24培養(yǎng)基靈敏度檢查使用6株菌見下表第29頁,共53頁，2024年2月25日，星期天309.4培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基接種

金黃色葡萄球菌2支

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基銅綠假單胞菌2支

12ml（7支）生孢梭菌2支

空白對照1支分別接種小于100cfu金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌菌懸液各2支,另1支不接種作為空白對照,培養(yǎng)3天，逐日觀察結(jié)果。五月24第30頁,共53頁，2024年2月25日，星期天319.5培養(yǎng)基適用性檢查

培養(yǎng)基接種枯草芽孢桿菌2支

胰酪大豆胨液體基白色念株菌2支9ml（7支）

黑曲霉2支

空白對照1支每分別接種小于100cfu枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接種作為空白對照,培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。

五月24第31頁,共53頁，2024年2月25日，星期天329.6

培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果判斷

空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管試驗菌生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。五月24第32頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3310.

方法適用性試驗試驗?zāi)康?1)進(jìn)行無菌檢查時，應(yīng)進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查；2)若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗；3)方法適用性試驗按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對每一試驗菌應(yīng)逐一進(jìn)行方法確認(rèn)。五月24第33頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3410.1

方法適用性試驗

菌種及菌液制備：除大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌

、

枯草芽孢桿菌

、

生孢梭菌、

白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。

注：大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

五月24第34頁,共53頁，2024年2月25日，星期天10.2

方法適用性試驗薄膜過濾法直接接種法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu試驗菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗菌同法操作。取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入小于l00cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體基6管，分別接入小于l00cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為對照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天。五月24第35頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3610.3方法適用性試驗結(jié)果判斷

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢驗條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用?？刹捎茫?)增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；2)使用中和劑，或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗。注：方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。五月24第36頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

11、供試品的無菌檢查

無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。供試品無菌檢查所采用的檢查和檢驗條件應(yīng)與方法適用性試驗確認(rèn)的方法相同。無菌試驗過程中，若需試驗表面活性劑、中和劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物無毒性。37五月24第37頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.1

供試品無菌檢查檢驗數(shù)量：

檢驗量：檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g或ml）。五月24第38頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.2

供試品的無菌檢查無抑菌作用及抗革蘭氏陽性為主的供試品以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭氏陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌;抗厭氧菌的供試品以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法適用性試驗，加菌量小于100cfu,供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應(yīng)生長良好。

陽性對照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：五月24第39頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.3

供試品的無菌檢查

陰性對照：供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照；陰性對照不得有菌生長。

五月2440第40頁,共53頁，2024年2月25日，星期天4111.4

供試品的無菌檢查

薄膜過濾法：薄膜過濾法應(yīng)采用封閉式薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥，為發(fā)揮濾膜最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試品經(jīng)薄膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜。每張濾膜每次沖洗量為100ml.,且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。五月24第41頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.5

供試品的無菌檢查水溶性供試品：取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含不少于100ml適宜稀釋的無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用，須用沖洗液沖洗濾膜。沖洗次數(shù)不少于三次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法適用性試驗。除生物制品外，一般樣品沖洗后，1份濾器加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。例如：五月24第42頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.6供試品的無菌檢查水溶性固體供試品：取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，然后按水溶液供試品項下的方法進(jìn)行操作。具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。五月24第43頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.7

供試品的無菌檢查具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）供試品：取規(guī)定量，每個小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶液供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。五月24第44頁,共53頁，2024年2月25日，星期天4511.8

供試品無菌檢查

直接接種法：

適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查的供試品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。除生物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)相等；生物制品無菌檢查時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支/瓶數(shù)為2：1。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗。

五月24第45頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.9供試品的無菌檢查例如：混懸液等非澄清水溶液供試品取規(guī)定量，等量接種至各管培養(yǎng)基中。固體供試品取規(guī)定量，直接等量接種至各管培養(yǎng)基中?；蚣舆m宜的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定量等量接種至培養(yǎng)基中。非水溶液供試品取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，等量接種至各管培養(yǎng)基中。敷料供試品取規(guī)定數(shù)量，以無菌操作拆開每個包裝，于不同部位剪取約100mg或1cm×3cm的供試品，等量接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。腸線、縫合線以及其它一次性適宜的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，等量接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。滅菌醫(yī)用器具取規(guī)定量，必要時應(yīng)將其拆散或切成下碎段，等量接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。放射性藥品取供試品1瓶（支），等量接種于裝量7.5ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體基中。每管接種0.2ml。五月24第46頁,共53頁，2024年2月25日，星期天11.10

供試品的無菌檢查培養(yǎng)及觀察：將接種的供試品后培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天；接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)分成兩等份，一份置30～35℃，一份置20～25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。若加入