藥品的微生物學(xué)檢查

藥品的微生物學(xué)檢查一、目的要求

1、了解微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌儀器設(shè)備

2、了解空氣、皮膚細(xì)菌檢查方法

3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.藥品的微生物限度檢查（一）

1）口服藥物的檢查:①藥品的預(yù)處理：②大腸桿菌的檢查：③細(xì)菌總數(shù)的檢查：

2）外用藥物的檢查:①藥品的預(yù)處理：②綠膿桿菌的檢查：③金黃色葡萄球菌的檢查：2.空氣、皮膚細(xì)菌檢查方法(驗(yàn)證)3.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋、消毒煮沸器、G6玻璃濾菌器裝置、潔凈工作臺、移動式紫外光燈、鼓風(fēng)式干烤箱、紫外線殺菌標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)一藥品的微生物限度檢查（一）實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌設(shè)備空氣和皮膚細(xì)菌檢查方法（綜合實(shí)驗(yàn)+基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)）第2頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

通過實(shí)驗(yàn)了解藥品微生物限定檢查法的意義、設(shè)計方法、細(xì)菌檢查常用的基本技術(shù)和程序，結(jié)果分析方法。藥品的微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃幤返奈⑸锵薅葯z查實(shí)驗(yàn)程序

一、藥品的預(yù)處理二、藥品的增菌培養(yǎng)、結(jié)果分析三、細(xì)菌分離鑒定、結(jié)果分析第3頁,共59頁，2024年2月25日，星期天口服藥外用藥藥品的微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)方法（一）

1.藥品的預(yù)處理2克藥品加20毫升生理鹽水，研磨制成懸液

2.細(xì)菌培養(yǎng)外用藥口服藥藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入亞碲酸鈉增菌液中37℃,24小時37℃,24小時第4頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

將剩余口服藥以10-110-210-310-4

進(jìn)行稀釋(以生理鹽水稀釋)

3.細(xì)菌總數(shù)測定從上述四個稀釋管中各取1ml混入溶化的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，冷卻后置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時

。取四個中試管各加9ml生理鹽水從剩余10ml懸液中取1ml加入上述四個稀釋管中1ml1ml10-110-410-210-39ml生理鹽水第5頁,共59頁，2024年2月25日，星期天一、目的要求:1、了解細(xì)菌培養(yǎng)接種技術(shù)

2、掌握細(xì)菌基本形態(tài)

3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（二）2.空氣、皮膚細(xì)菌檢查結(jié)果測定。3.講授基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯）。4.細(xì)菌在三種不同物理性狀培養(yǎng)基上的接種方法(基本技能)

液體培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 雙糖含鐵半固體斜面培養(yǎng)基5.顯微鏡下觀察

細(xì)菌的基本形態(tài):球菌、枯草桿菌、霍亂弧菌。特殊結(jié)構(gòu)：肺炎莢膜、變形鞭毛、破傷風(fēng)芽胞。6.培養(yǎng)基的種類和用途普通培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)二藥品的微生物限度檢查（二）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查及培養(yǎng)接種技術(shù)第6頁,共59頁，2024年2月25日，星期天一、空氣、皮膚細(xì)菌培養(yǎng)現(xiàn)象觀察

（一）記錄空氣微生物培養(yǎng)結(jié)果菌落數(shù)目、大小、邊緣、顏色、粗糙（光滑）（二）記錄皮膚微生物培養(yǎng)結(jié)果比較消毒前后細(xì)菌菌落數(shù)，菌落特點(diǎn)。第7頁,共59頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基分類根據(jù)物理性狀分類：液體培養(yǎng)基主要用于增菌半固體培養(yǎng)基用于檢測動力及保存菌種固體培養(yǎng)基用于分離鑒定細(xì)菌根據(jù)用途分類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基第8頁,共59頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備程序調(diào)配→矯正pH（7.0-7.6）→分裝→滅菌（121.3℃，20-30分鐘）→放入冰箱冷藏備用。因高壓之后pH值會下降0.1左右，所以矯正pH時應(yīng)比所需的pH高。鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24小時，然后觀察。第9頁,共59頁，2024年2月25日，星期天二、細(xì)菌的接種技術(shù)材料普通瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、半固體斜面培養(yǎng)基大腸埃希菌培養(yǎng)物（１套／臺）第10頁,共59頁，2024年2月25日，星期天方法1.平板劃線接種法（1）平行劃線法（2）分區(qū)劃線法2.瓊脂斜面的接種方法3.液體培養(yǎng)基接種法4.半固體接種法第11頁,共59頁，2024年2月25日，星期天分區(qū)劃線法第12頁,共59頁，2024年2月25日，星期天菌落第13頁,共59頁，2024年2月25日，星期天斜面移種技術(shù)第14頁,共59頁，2024年2月25日，星期天菌苔第15頁,共59頁，2024年2月25日，星期天液體移種技術(shù)第16頁,共59頁，2024年2月25日，星期天穿刺技術(shù)第17頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

取出前次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物觀察：

1.口服藥物1)細(xì)菌鑒定：在膽鹽乳糖增菌液中有無細(xì)菌生長：增菌液變混濁―――――有

-----接種在伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。

2)細(xì)菌總數(shù)測定：選擇30-300個菌落平板，細(xì)菌總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)藥物的微生物限度檢查方法（二）第18頁,共59頁，2024年2月25日，星期天2.外用藥1)判定膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物及亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物有無細(xì)菌生長：增菌液變混濁―――有2)細(xì)菌鑒定：（1）將膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物無菌接種在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上面。方法：斜面化線接種；（2）將亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物，無菌接種在卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。

37℃恒溫孵育箱24小時培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。第19頁,共59頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌基本形態(tài)球菌桿菌螺形菌第20頁,共59頁，2024年2月25日，星期天葡萄球菌第21頁,共59頁，2024年2月25日，星期天鏈球菌第22頁,共59頁，2024年2月25日，星期天大腸埃希菌第23頁,共59頁，2024年2月25日，星期天枯草桿菌第24頁,共59頁，2024年2月25日，星期天霍亂弧菌第25頁,共59頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)鞭毛莢膜芽孢第26頁,共59頁，2024年2月25日，星期天破傷風(fēng)梭菌spore第27頁,共59頁，2024年2月25日，星期天一、目的要求:1、了解細(xì)菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察

2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（三）2.細(xì)菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察

1）液體培養(yǎng)基---沉淀、渾濁、表面生長現(xiàn)象。

2）三葡、三鏈、大腸與副傷乙培養(yǎng)基的菌落特征、溶血環(huán)觀察。

3）雙糖含鐵培養(yǎng)基---動力、氣體、硫化氫、分解乳糖觀察。

4）結(jié)核桿菌菌落的觀察。 3.中草藥、抗生素抑菌試驗(yàn)

1）中草藥---大蒜汁、黃連、黃芩、黃柏。

2）抗生素---青霉素、慶大、氨芐、新諾明、生理鹽水。實(shí)驗(yàn)三

藥品的微生物限度檢查（三）微生物的形態(tài)學(xué)檢查及藥物的敏感性試驗(yàn)

第28頁,共59頁，2024年2月25日，星期天1）從伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上-----

挑取黑色帶有金屬光澤的濕潤菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)。

2）觀察外用藥物在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長狀況。記錄被檢菌色素的溶解性質(zhì)、液化明膠的狀況及菌苔粘稠度等。革蘭氏染色鏡下觀察其菌落形態(tài)。根據(jù)上述被檢菌落的生物性質(zhì)和狀況及細(xì)菌形態(tài)，確定該被檢菌的名稱。

3）從卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上生長，挑取黃色的濕潤菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)。藥物的微生物限度檢查（三）第29頁,共59頁，2024年2月25日，星期天2.細(xì)菌的生長現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察混濁生長菌膜菌沉淀均勻渾濁對照第30頁,共59頁，2024年2月25日，星期天菌膜生長第31頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共59頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共59頁，2024年2月25日，星期天3.中草藥、抗生素抑菌試驗(yàn)第35頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

紙片法第36頁,共59頁，2024年2月25日，星期天六、革蘭染色法原理：革蘭陽性菌與革蘭陰性菌細(xì)胞壁差異應(yīng)用方法標(biāo)本片制備革蘭染色結(jié)果第37頁,共59頁，2024年2月25日，星期天

2.革蘭染色（1）初染：滴加結(jié)晶紫染液l～2滴，1分鐘.水洗（2）媒染：滴加碘液，l～2滴，作用1分鐘后水洗。（3）脫色：滴加95％酒精數(shù)滴，（約15～30秒），立即水洗。（4）復(fù)染：滴加稀釋復(fù)紅染液1～2滴，作用1分鐘后水洗。（5）結(jié)果：牙垢標(biāo)本中革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌染成紅色。其中真菌(白色念珠菌)染成紫色，而螺旋體等被染成紅色?？谇恢忻撀涞慕M織細(xì)胞及個別白細(xì)胞被染成紅色。其細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈深紅色。

第38頁,共59頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細(xì)菌及其他病原微生物一、目的要求

1、了解抗酸染色方法及各種病毒和細(xì)菌的菌落形態(tài)

2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、藥物的藥物的微生物限度檢查（四）

1）將口服藥物中的細(xì)菌分別接種：①蛋白胨水培養(yǎng)基；②葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；③枸櫞酸鹽（西蒙氏）培養(yǎng)基。同時接種產(chǎn)氣桿菌于上述培養(yǎng)管做對照，以備進(jìn)行IMViC試驗(yàn)。

2）取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細(xì)菌進(jìn)行血漿凝固酶檢測,依據(jù)其反應(yīng)結(jié)果,確定該菌的性質(zhì)及名稱。2、抗酸染色 3、真菌培養(yǎng)物的觀察------黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌絲，酵母菌菌落的觀察。4、記錄中草藥、抗生素抑菌試驗(yàn)結(jié)果5、觀察雞胚的結(jié)構(gòu) 第39頁,共59頁，2024年2月25日，星期天---------------------------------------------------試驗(yàn)培養(yǎng)基加試劑試驗(yàn)結(jié)果大腸埃希菌產(chǎn)氣桿菌蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11枸櫞酸鹽2管11第40頁,共59頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細(xì)菌及其他病原微生物

取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細(xì)菌進(jìn)行血漿凝固酶檢測,依據(jù)其反應(yīng)結(jié)果,確定該菌的性質(zhì)及名稱。

第41頁,共59頁，2024年2月25日，星期天二.血漿凝固酶試驗(yàn)原理：非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生血漿凝固酶而致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人等血漿發(fā)生凝固。方法：1.取潔凈玻片，用記號筆畫兩個圈并標(biāo)號，其中一個滴加生理鹽水另一個滴加兔血漿。2.接種環(huán)燒灼滅菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理鹽水中研勻混懸，另1/2在兔血漿中研勻混懸，靜止片刻，觀察結(jié)果。結(jié)果：凝集呈顆粒狀判定為血漿凝固酶試驗(yàn)（+），呈均勻混濁狀不凝集判定為（-）第42頁,共59頁，2024年2月25日，星期天方法：1.取潔凈玻片，用記號筆畫兩個圈并標(biāo)號，其中一個滴加生理鹽水另一個滴加兔血漿。2.接種環(huán)燒灼滅菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理鹽水中研勻混懸，另1/2在兔血漿中研勻混懸，靜止片刻，觀察結(jié)果。結(jié)果：凝集呈顆粒狀判定為血漿凝固酶試驗(yàn)（+），呈均勻混濁狀不凝集判定為（-）第43頁,共59頁，2024年2月25日，星期天制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸復(fù)紅初染（加溫、蓋濾紙片）5min---水洗；3％鹽酸酒精脫色（15S,水洗）；美蘭復(fù)染（1min，水洗）-濾紙吸干鏡檢?？顾崛旧襟E第44頁,共59頁，2024年2月25日，星期天結(jié)核桿菌第45頁,共59頁，2024年2月25日，星期天抗生素體外抑菌試驗(yàn)（二）

記錄紙片法結(jié)果測量抑菌環(huán)直徑

第46頁,共59頁，2024年2月25日，星期天病毒的分離培養(yǎng)—雞胚接種動物接種雞胚培養(yǎng)組織細(xì)胞培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)方法：第47頁,共59頁，2024年2月25日，星期天病毒的分離培養(yǎng)—雞胚接種第48頁,共59頁，2024年2月25日，星期天病毒名稱接種部位雞胚胚齡（天）痘類病毒絨毛尿囊膜10～13流感、副流感、腮腺炎病毒尿囊9～11嗜神經(jīng)病毒卵黃囊5～8初次分離標(biāo)本羊膜腔10～12病毒的分離培養(yǎng)—雞胚培養(yǎng)第49頁,共59頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)五藥物的微生物限度檢查（五）一、目的要求掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以生化反應(yīng)（IMViC）檢測口服藥中細(xì)菌的性質(zhì)。第50頁,共59頁，2024年2月25日，星期天---------------------------------------------------試驗(yàn)培養(yǎng)基加試劑試驗(yàn)結(jié)果大腸埃希菌產(chǎn)氣桿菌吲哚(I)蛋白胨水2管苯甲醛試劑0.5ml(5滴)紅陽性（+）無色變陰性（-）甲基紅(M)葡萄糖蛋白胨水2管甲基紅5滴紅色陽性（+）黃色陰性（-）VP葡萄糖蛋白胨水2管培氏乙6滴——萘酚試劑6滴無色變陰性（-）紅色陽性（+）枸椽酸鹽(C)枸櫞酸鹽2管綠無色變陰性（-）綠—藍(lán)色陽性（+）第51頁,共59頁，2024年2月25日，星期天IMViC結(jié)果吸哚試驗(yàn)：取出后每管滴加柯氏試劑0.5ml，靜止片刻，觀察有無顏