酶工程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

酶工程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

第一節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)一、酶的生物合成

遺傳信息傳遞的中心法則轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA

第2頁,共63頁，2024年2月25日，星期天（一）RNA的生物合成--轉(zhuǎn)錄(transcription)

定義以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。.第3頁,共63頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄模板

啟動(dòng)子（promotor)

終止子(terminator)模板鏈（templatestrand）反意義鏈(antisensestrand)編碼鏈(codingstrand)有意義鏈(sensestrand)DNA5′5′3′3′反意義鏈:指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條DNA鏈有意義鏈:無轉(zhuǎn)錄功能的一條DNA鏈.第4頁,共63頁，2024年2月25日，星期天TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’第5頁,共63頁，2024年2月25日，星期天RNA的轉(zhuǎn)錄過程(三步)1.起始2.延長(zhǎng)3.終止

第6頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（

2

）

起始因子第7頁,共63頁，2024年2月25日，星期天RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長(zhǎng)階段5

3

RNA

啟動(dòng)子（promotor)

終止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

離開第8頁,共63頁，2024年2月25日，星期天RNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動(dòng)方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長(zhǎng)部位第9頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

定義以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。（二）蛋白質(zhì)的生物合成--翻譯(translation)

第10頁,共63頁，2024年2月25日，星期天酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼的堿基配對(duì)第11頁,共63頁，2024年2月25日，星期天AUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’受位(A位)給位(P位)大亞基小亞基第12頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)的合成過程

（大腸桿菌）

氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止與釋放第13頁,共63頁，2024年2月25日，星期天氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi

對(duì)于E.coli而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。第14頁,共63頁，2024年2月25日，星期天在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段第15頁,共63頁，2024年2月25日，星期天肽鏈合成的起始階段1.mRNA與小亞基結(jié)合：形成30S-mRNA-IF3復(fù)合物2.AUG與fMet-tRNA結(jié)合：

30S-mRNA-IF3

fMet-tRNA-IF2-GTPfMet-tRNA正好位于mRNA的起始密碼子上（AUG）。3.大小亞基結(jié)合IF130S起始復(fù)合物第16頁,共63頁，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亞基mRNAfMet-tRNAGTP大亞基GDP+Pi受位給位fMetfMet肽鏈合成的起始階段第17頁,共63頁，2024年2月25日，星期天肽鏈合成的延伸階段1.進(jìn)位:氨基酰-tRNA進(jìn)入受位;2.轉(zhuǎn)肽:形成肽鍵,在轉(zhuǎn)肽酶作用下,給位與受位結(jié)合;3.移位:核蛋白體向3’端移動(dòng)一個(gè)密碼子的位置,空出受位,不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、移位,使肽鏈延長(zhǎng)。第18頁,共63頁，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’UACfMet蘇UGUAUGACA5’UACfMet蘇UGUGUUAUGACA5’UACfMet蘇UGUGUUAUGACA5’fMet蘇UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體進(jìn)位轉(zhuǎn)肽移位Mg+K+第19頁,共63頁，2024年2月25日，星期天肽鏈合成的終止階段1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合;2.酯鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離.

第20頁,共63頁，2024年2月25日，星期天AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’終終AUGUAA5’UAC3’終5’3’UAC終肽鏈第21頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。第22頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

操縱子——基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì),structuralgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動(dòng)子（promotorgene,P）（一）基因調(diào)控理論

JacobandMonod的操縱子學(xué)說（operontheory）

第23頁,共63頁，2024年2月25日，星期天基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導(dǎo)劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子第24頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)

（一種變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。第25頁,共63頁，2024年2月25日，星期天cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖

啟動(dòng)基因（promotorgene）（啟動(dòng)子）：有兩個(gè)位點(diǎn)：

（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開始。

第26頁,共63頁，2024年2月25日，星期天操縱基因（Operatergene）:

位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。第27頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(二)酶合成調(diào)節(jié)的類型

1.誘導(dǎo)

(induction)

組成酶：細(xì)胞固有的酶類。誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶。

2.阻遏

(repression)

分解代謝物阻遏(cataboliterepression)

反饋?zhàn)瓒?feedbackrepression)第28頁,共63頁，2024年2月25日，星期天（三）酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.酶合成的誘導(dǎo)加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進(jìn)行。酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成。第29頁,共63頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動(dòng)子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖

阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)第30頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.末端產(chǎn)物阻遏

由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：

（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。第31頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

色氨酸操縱子——酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)第32頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。第33頁,共63頁，2024年2月25日，星期天分解代謝物阻遏現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。

這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。第34頁,共63頁，2024年2月25日，星期天分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)第35頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸）

1.誘變育種

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?/p>

2.基因工程育種

第36頁,共63頁，2024年2月25日，星期天（二）條件控制1.添加誘導(dǎo)物酶的底物類似物最有效。2.降低阻遏物濃度

除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏避免培養(yǎng)基過于豐富添加一定量的cAMP第37頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.添加表面活性劑

離子型對(duì)細(xì)胞有毒害作用表面活性劑Tween－80

非離子型增加細(xì)胞通透性

TritonX－1004.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑第38頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

第二節(jié)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

一、細(xì)胞生長(zhǎng)的階段

在分批培養(yǎng)(batchculture)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)一般要經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰亡期4個(gè)階段。第39頁,共63頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

O-A調(diào)整期

A-B生長(zhǎng)期

B-D平衡期

D-E衰亡期

第40頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

二、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)

（一）酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為4種模式，即：同步合成型生長(zhǎng)偶聯(lián)型——

中期合成型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型——

滯后合成型第41頁,共63頁，2024年2月25日，星期天1.同步合成型

酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。第42頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.中期合成型—生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊形式酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

第43頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.延續(xù)合成型（又稱部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型）

酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線第44頁,共63頁，2024年2月25日，星期天4.滯后合成型（又稱非生長(zhǎng)偶聯(lián)型）

只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

第45頁,共63頁，2024年2月25日，星期天總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素高：可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼

1）mRNA的穩(wěn)定性續(xù)合成酶差：隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或平衡期后，酶才開始合成。第46頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。對(duì)于：同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。第47頁,共63頁，2024年2月25日，星期天(二)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：式中X——細(xì)胞濃度(g/L)

——細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1)

——生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)

——非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時(shí)間(h)第48頁,共63頁，2024年2月25日，星期天生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型

非生長(zhǎng)偶聯(lián)型

第49頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

一.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法

1.固體培養(yǎng):特別適合于霉菌培養(yǎng)

2.液體深層發(fā)酵:目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式

3.固定化細(xì)胞:需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器

第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第50頁,共63頁，2024年2月25日，星期天二.微生物酶的類型

1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。

2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。第51頁,共63頁，2024年2月25日，星期天三、產(chǎn)酶微生物的分離和選育

1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件（1）酶產(chǎn)量高（2）易培養(yǎng)（生長(zhǎng)速率高、營(yíng)養(yǎng)要求低）（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易退化（4）易分離提純（5）安全可靠（不是致病菌）第52頁,共63頁，2024年2月25日，星期天2.常用的產(chǎn)酶微生物⑴細(xì)菌：大腸桿菌；枯草芽胞桿菌⑵放線菌：鏈霉菌⑶霉菌：黑曲霉；米曲霉；根霉；木霉，青霉⑷酵母：啤酒酵母；假絲酵母第53頁,共63頁，2024年2月25日，星期天3.產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場(chǎng)所采集樣品

2)富集培養(yǎng):投其所好，取其所抗

3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pureculture）。

4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。

5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)為主。

第54頁,共63頁，2024年2月25日，星期天

-淀粉酶的篩選