重組人干擾素生產(chǎn)工藝

重組人干擾素生產(chǎn)工藝干擾素概述干擾素的種類干擾素的理化性質(zhì)干擾素的生物學(xué)活性干擾素的臨床應(yīng)用干擾素的生產(chǎn)工藝路線第2頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素概念：干擾素是一種細(xì)胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。簡稱IFN。發(fā)現(xiàn)：干擾素是1957年英國科學(xué)家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質(zhì)稱為“干擾素”。以后科學(xué)家們進一步發(fā)現(xiàn)，機體對入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進行防御。當(dāng)機體細(xì)胞受到病毒感染時，機體細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復(fù)制，它是機體抗病毒感染的防御系統(tǒng)。

第3頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素的理化性質(zhì)143-166aa；MW:18-40ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質(zhì)。第4頁,共41頁，2024年2月25日，星期天Ⅰ型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應(yīng)不是直接的，而是通過對宿主細(xì)胞的作用引起的。①對干擾素敏感的細(xì)胞表面存在干擾素受體，該細(xì)胞核內(nèi)有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進病毒mRNA降解。②干擾素能提高細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達水平，受到病毒感染的細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的增加有助于向Tc細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解。③干擾素可增強NK細(xì)胞（自然殺傷免疫細(xì)胞）對病毒感染的殺傷能力。干擾素的生物學(xué)活性正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。廣譜抗病毒活性機制第5頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素合成及作用宿主細(xì)胞（白細(xì)胞）第6頁,共41頁，2024年2月25日，星期天抗腫瘤作用機制Ⅰ型干擾素能抑制細(xì)胞的DNA合成，減慢細(xì)胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對腫瘤細(xì)胞的作用比對正常細(xì)胞的作用強500～1000倍。另外，Ⅱ型干擾素也可通過增強機體免疫機制、加強免疫監(jiān)督功能來實現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng)。干擾素原始品種價格在1000~2000多，產(chǎn)量很低。運用生物技術(shù)生產(chǎn)后的價格在40~60之間，而且產(chǎn)量也很樂觀，運用價值大大提升。第7頁,共41頁，2024年2月25日，星期天免疫調(diào)節(jié)活性機制

免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細(xì)胞活性的影響，如對巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。對巨噬細(xì)胞的作用：IFNγ可使巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細(xì)胞表面表達Fc受體，促進巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。對淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時投入會產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強的效果。在適宜的條件下，IFNγ對B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進作用，但不能促進其增殖。IFNγ能增強TH1細(xì)胞的活性，增強細(xì)胞免疫功能；但對TH2細(xì)胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。對其它細(xì)胞的作用：IFNγ對其他細(xì)胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細(xì)胞，增強其吞噬能力；②活化NK細(xì)胞，增強其細(xì)胞毒作用；③使某些正常不表達MHCⅡ類分子的細(xì)胞（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞）表達MHCⅡ類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；④使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對中性粒細(xì)胞的粘附能力更強，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞（增強免疫系統(tǒng)）。第8頁,共41頁，2024年2月25日，星期天重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ第9頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFNα-n3，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細(xì)胞來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性第10頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：

1999年：IFNα-n1,批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應(yīng)用。第11頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴(yán)格動物無限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：第12頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:第13頁,共41頁，2024年2月25日，星期天基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏

基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫的建立與保藏第14頁,共41頁，2024年2月25日，星期天基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建第15頁,共41頁，2024年2月25日，星期天第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR)

制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。第16頁,共41頁，2024年2月25日，星期天第二步：表達載體構(gòu)建?IFN基因與表達載體連接?轉(zhuǎn)化大腸桿菌?篩選陽性克隆?獲得序列正確表達載體第17頁,共41頁，2024年2月25日，星期天第三步：工程菌構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿菌篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種第18頁,共41頁，2024年2月25日，星期天基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：細(xì)菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。（2）具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學(xué)效價不低于2.0×109IU/L。第19頁,共41頁，2024年2月25日，星期天菌種庫的建立與保藏?QC（質(zhì)量控制）：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性?菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。第20頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程第21頁,共41頁，2024年2月25日，星期天搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。第22頁,共41頁，2024年2月25日，星期天種子罐培養(yǎng)接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速DO（溶解氧）為30%，3～4h，OD（吸光度）>4.0。檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。第23頁,共41頁，2024年2月25日，星期天LB培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基是一種培養(yǎng)基的名稱,生化分子實驗中一般用該培養(yǎng)基來預(yù)培養(yǎng)菌種,使菌種成倍擴增,達到使用要求.培養(yǎng)的菌種一般是經(jīng)過改造的無法在外界環(huán)境單獨存活和擴增的工程菌.通過培養(yǎng)工程菌,我們可以表達大量的外源蛋白,也可以拿到帶有外源基因的質(zhì)粒.這個名字來源於英語的lysogenybroth，即溶菌肉湯。（貝爾尼塔）第24頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查第25頁,共41頁，2024年2月25日，星期天菌體收集連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。第26頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素的分離純化工藝過程干擾素分離工藝過程干擾素的純化工藝過程第27頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預(yù)處理初級分離第28頁,共41頁，2024年2月25日，星期天(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。第29頁,共41頁，2024年2月25日，星期天EDTA本品為鈣離子絡(luò)合劑，洗滌劑，血液抗凝劑。生化研究中用作鈣螯合劑，消除微量重金屬導(dǎo)致的酶催化反應(yīng)中的抑制作用。PMSF分離純化劑，有劇毒，使用時微量即可。第30頁,共41頁，2024年2月25日，星期天(2)預(yù)處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。第31頁,共41頁，2024年2月25日，星期天(3)離心

連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。第32頁,共41頁，2024年2月25日，星期天（4）初級分離

鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。第33頁,共41頁，2024年2月25日，星期天干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝第34頁,共41頁，2024年2月25日，星期天(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。溶解：

2℃～10℃，勻漿，完全溶解。第35頁,共41頁，2024年2月25日，星期天(2)沉淀與疏水層析

等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。第36頁,共41頁，2024年2月25日，星期天等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40ms/cm，2