辣根過(guò)氧化物酶的提取純化以及應(yīng)用

辣根過(guò)氧化物酶的提取純化以及應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶簡(jiǎn)介辣根，是十字花科多年生直立草本植物，在世界大部分溫和地區(qū)都有種植。它的根不但可以烹調(diào)，同時(shí)還含有一種含量豐富的過(guò)氧化物酶，這些同工酶統(tǒng)稱為“辣根過(guò)氧化物酶(HRP)”。其中含量最為豐富的是辣根過(guò)氧化物酶同工酶C(HRPC)現(xiàn)在HRPC的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制已經(jīng)被闡明第2頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)反應(yīng)機(jī)理分離純化特性分析應(yīng)用第3頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRP的結(jié)構(gòu)

辣根過(guò)氧化物酶同工酶C是一條由308個(gè)氨基酸組成的肽鏈。在這條肽鏈中有4個(gè)由兩分子半胱氨酸組成的二硫鍵,它們分別是11～91、44～49、97～301和17～209;同時(shí)還存在一個(gè)由Asp99和Arg123組成的鹽橋。第4頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRP的結(jié)構(gòu)HRPC含有兩個(gè)不同的金屬中心:正鐵原卟啉(即血紅素)和兩個(gè)鈣原子。這兩個(gè)金屬中心對(duì)酶的整體結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的。通過(guò)血紅素中鐵原子的一個(gè)軸向結(jié)合點(diǎn)與肽鏈上His170側(cè)鏈的N原子結(jié)合,使血紅素垂直連接在His170上(下圖);而卟啉鐵的另一個(gè)軸向結(jié)合點(diǎn)在靜態(tài)酶中則是空著的,當(dāng)有H2O2

存在時(shí),該結(jié)合點(diǎn)就能與CO、氰化物、氟化物或疊氮化物等小分子結(jié)合。第5頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRPC的部分結(jié)構(gòu)特征第6頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRPC三維結(jié)構(gòu)第7頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRP的結(jié)構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)總體上看來(lái)大部分是α螺旋,但其中也包含一些小的β折疊。在血紅素平面上下兩側(cè)存在著兩個(gè)空白區(qū)域,該區(qū)域可能是由鈣結(jié)合位點(diǎn)與其他結(jié)構(gòu)元素共同作用而成的,也可能是基因復(fù)制后留下的產(chǎn)物。第8頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRP的結(jié)構(gòu)在血紅素平面的上下兩側(cè)存在著兩個(gè)鈣原子的結(jié)合位點(diǎn),它們通過(guò)一個(gè)氫鍵群與血紅素結(jié)合區(qū)域相連。每個(gè)鈣原子都是7供氧配合體,它們能同時(shí)與主肽鏈上含羰基的氨基酸,側(cè)鏈上的Asp、Ser和Thr,以及一個(gè)末端結(jié)構(gòu)水分子結(jié)合。鈣離子的丟失將會(huì)導(dǎo)致HRPC酶失活和熱穩(wěn)定性的下降,還能使血紅素的構(gòu)型發(fā)生改變。第9頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天HRP的作用機(jī)制由HRP催化的多數(shù)反應(yīng)可由以下等式表示：

AH+H2O2

→·A+2H2O其中AH是還原性底物,·A是自由基。還原性底物包括芳香族化合物,酚類化合物,吲哚,胺類和磺酸鹽。第10頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

HRPC以阿魏酸為底物的催化循環(huán)第11頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天催化循環(huán)的第一步是H2O2和靜態(tài)酶中的Fe(Ⅲ)反應(yīng)生成化合物Ⅰ(HRPⅠ),HRPⅠ是一個(gè)高氧化態(tài)的催化中間體,包含一個(gè)含氧Fe(Ⅳ)中心和一個(gè)帶正電荷的卟啉。由一分子還原性底物的加入HRPⅠ,生成另一個(gè)含有含氧Fe(Ⅳ)中心的催化中間體HRPⅡ。由一分子還原性底物參加HRPⅡ,使HRPⅡ還原成靜態(tài)酶。圖中生成的兩個(gè)帶電子的產(chǎn)物可能會(huì)引起更復(fù)雜的反應(yīng),包括形成二倍體、三倍體、多聚體,以及啟動(dòng)一個(gè)以該產(chǎn)物為底物的反應(yīng)。第12頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天辣根過(guò)氧化物酶的分離純化新鮮干凈辣根勻漿尼龍紗布過(guò)濾上清40%-80%硫酸銨鹽析沉淀用水溶解并在水中進(jìn)行透析用-20℃丙酮制沉淀離心，取上清水溶解并透析第13頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天辣根過(guò)氧化物酶的分離純化梯度洗脫取第二個(gè)酶純高峰部分在自來(lái)水中透析上樣于CM-23纖維素上樣于DEAE-52取酶活高峰部分濃縮，既得純化辣根過(guò)氧化物酶梯度洗脫第14頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

pH對(duì)

HRP活力的影響在不同的酸度條件下,分別測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化OPD的初始反應(yīng)速率(dA/dt),以dA/dt對(duì)pH值做圖發(fā)現(xiàn),在pH值4.5～4.75范圍內(nèi),HRP活力呈上升趨勢(shì),至pH值為4.75時(shí)HRP活力達(dá)到最大.以后隨著pH值的增高,其活力呈下降的趨勢(shì).HRP催化H2O2氧化OPD體系的最適pH為4.75.第15頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天pH對(duì)辣根過(guò)氧化物酶活力的影響pH對(duì)溶液中HRP穩(wěn)定性的影響第16頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

pH對(duì)

HRP穩(wěn)定性的影響HRP分別在pH2.5～5溶液中保純7天后,HRP催化反應(yīng)速率為0,說(shuō)明HRP在該條件下保純7天后已完全失活.在pH6.0～8.0范圍內(nèi),HRP催化反應(yīng)的初始速率隨pH值的增加而逐漸增大.當(dāng)pH值達(dá)到8.0以后反應(yīng)速率趨于穩(wěn)定,說(shuō)明HRP在偏堿性緩沖液中的穩(wěn)定性較高,而在酸性條件下HRP容易失活,其原因可能是由于在堿性條件下酶的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,酶活性處于休眠狀態(tài)第17頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天辣根過(guò)氧化物酶應(yīng)用酚類化合物是常見的有毒有機(jī)污染物,含酚廢水在我國(guó)水污染控制中被列為重點(diǎn)解決的有害廢水之一,它的大量排放對(duì)水體、土壤造成嚴(yán)重的污染,進(jìn)而危害人類的健康。HRP在H2O2存在時(shí)能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。張國(guó)平等人對(duì)用辣根過(guò)氧化物酶處理廢水中的五氯酚進(jìn)行了研究第18頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

pH值對(duì)去除率的影響

在pH=2～8的范圍內(nèi)測(cè)定了五氯酚在辣根過(guò)氧化物酶和H2O2

的作用下的去除率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見左圖。由圖可見,在pH值為4和5時(shí),去除率達(dá)95%以上,為最佳pH范圍。

pH值對(duì)去除率的影響第19頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

H2O2

對(duì)去除率的影響采用不同的H2O2

用量與0.05mmol/L五氯酚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(辣根過(guò)氧化物酶是過(guò)量的),測(cè)定五氯酚的去除率,結(jié)果見左圖。當(dāng)H2O2

用量為0～0.025mmol/L時(shí),五氯酚去除率按比例上升(也即殘余五氯酚濃度按比例下降),表明H2O2

與PCP有著固定的反應(yīng)計(jì)量比。當(dāng)H2O2達(dá)到0.025mmol/L以上時(shí),去除率已達(dá)最高,說(shuō)明這時(shí)H2O2

用量已飽和。

H2O2

對(duì)去除率的影響第20頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同條件下的去除速率總的來(lái)說(shuō),反應(yīng)是相當(dāng)快的,所有的反應(yīng)都在15min內(nèi)進(jìn)行了一半以上。當(dāng)H2O2/PCP相同時(shí),酶用量多,則反應(yīng)速度快。對(duì)于H2O2/PCP=0.5的2個(gè)反應(yīng),酶用量為0.1U/mL時(shí)只用15min就獲得了80%以上的去除率,而酶用量為0.05U/mL時(shí)則用了40min。當(dāng)酶用量相同(同為0.1U/mL)時(shí),H2O2/PCP=1時(shí)的去除速度比H2O2/PCR=0.5時(shí)要快,前者只用8min就獲得了80%以上的去除率,而后者則用了15min。適度增加H2O2

可以加快反應(yīng),太過(guò)量的H2O2

也會(huì)對(duì)反應(yīng)有抑制作用不同條件下的去除速率第21頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天其他應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶是臨床