酶工程教案 資料

酶工程簡介酶工程（enzymeengineering）是在1971年第一屆國際酶工程會議上才得到命名的一項(xiàng)新技術(shù)。酶工程主要研究酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和理論研究等方面的應(yīng)用。根據(jù)研究和解決問題的手段不同將酶工程分為化學(xué)酶工程和生物酶工程。第一章酶學(xué)概論（Enzyme）新陳代謝是生命活動的基礎(chǔ)，是生命活動最重要的特征。而構(gòu)成新陳代謝的許多復(fù)雜而有規(guī)律的物質(zhì)變化和能量變化，都是在酶催化下進(jìn)行的。生命的生長發(fā)育、繁殖、遺傳、運(yùn)動、神經(jīng)傳導(dǎo)等生命活動都與酶的催化過程緊密相關(guān)，可以說，沒有酶的參與，生命活動一刻也不能進(jìn)行。第一節(jié)酶的一般概念一、酶的概念及化學(xué)本質(zhì)（一）

酶的概念：酶是生物體活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化活性和特定空間構(gòu)象的生物大分子，包括蛋白質(zhì)及核酸，又稱為生物催化劑。（二）

酶的化學(xué)本質(zhì)：絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),少數(shù)是核酸RNA，后者稱為核酶。本章主要討論以蛋白質(zhì)為本質(zhì)的酶。二、酶的組成與分類（一）

根據(jù)酶的組成成分，酶可分為：單成分酶（單純酶）、多成分酶（復(fù)合酶）單純酶(simpleenzyme)是基本組成單位僅為氨基酸的一類酶。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均屬此列。復(fù)合酶(conjugatedenzyme)的催化活性，除蛋白質(zhì)部分(酶蛋白apoenzyme)外，還需要非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，即所謂酶的輔助因子(cofactors)，兩者結(jié)合成的復(fù)合物稱作全酶(holoenzyme)，即：全酶酶蛋白輔助因子(結(jié)合蛋白質(zhì))(蛋白質(zhì)部分)(非蛋白質(zhì)部分)酶的輔助因子可以是金屬離子，也可以是小分子有機(jī)化合物。常見酶含有的金屬離子有K+、Na+、Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。它們或者是酶活性的組成部分；或者是連接底物和酶分子的橋梁；或者在穩(wěn)定酶蛋白分子構(gòu)象方面所必需。小分子有機(jī)化合物是一些穩(wěn)定的小分子物質(zhì)，其主要作用是在反應(yīng)中傳遞電子、質(zhì)子或一些基團(tuán)，?？砂雌渑c酶蛋白結(jié)合的緊密程度不同分成輔酶和輔基兩大類。輔酶(coenzyme)與酶蛋白結(jié)合疏松，可以用透析或超濾方法除去；輔基(prostheticgroup)與酶蛋白結(jié)合緊密，不易用透析或超濾方法除去，輔酶和輔基的差別僅僅是它們與酶蛋白結(jié)合的牢固程度不同，而無嚴(yán)格的界限。大多數(shù)維生素(特別是B族維生素)是組成許多酶的輔酶或輔基的成分。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見下章維生素。體內(nèi)酶的種類很多，而輔酶(基)的種類卻較少，通常一種酶蛋白只能與一種輔酶結(jié)合，成為一種特異的酶，但一種輔酶往往能與不同的酶蛋白結(jié)合構(gòu)成許多種特異性酶。酶蛋白在酶促反應(yīng)中主要起識別底物的作用，酶促反應(yīng)的特異性、高效率以及酶對一些理化因素的不穩(wěn)定性均決定于酶蛋白部分。常見的輔酶，如下表所示：輔酶形式主要作用所含B族維生素硫胺素焦磷酸酯(TPP)α-酮酸氧化脫羧、酮基轉(zhuǎn)換作用硫胺素(B1)6,8-二硫辛酸α-酮酸氧化脫羧硫辛酸輔酶A(CoA)?；D(zhuǎn)換作用泛酸黃素單核苷酸(FMN)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)氫原子轉(zhuǎn)移氫原子轉(zhuǎn)移核黃素(B2)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)氫原子轉(zhuǎn)移氫原子轉(zhuǎn)移尼克酰胺(PP)磷酸吡哆醛氨基酸代謝吡哆素(B6)生物素羧化作用生物素(H)四氫葉酸"一碳基團(tuán)"轉(zhuǎn)移葉酸5-甲基鈷銨素5-脫氧腺苷鈷銨素甲基轉(zhuǎn)移鈷胺素(B12)(二)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分子組成形式分為：1.單體酶：只含一條肽鏈，分子量小，大多數(shù)水解酶屬于此類。2.寡聚酶：由幾條或幾十條多肽鏈組成，每條肽鏈?zhǔn)且粋€(gè)亞基，單獨(dú)的亞基無酶的活力。如己糖激酶、乳酸脫氫酶，均含四個(gè)亞基，谷氨酸脫氫酶含六個(gè)亞基。3.多酶復(fù)合體：若干個(gè)功能相關(guān)的酶彼此嵌合形成的復(fù)合體。每個(gè)單獨(dú)的酶都具有活性，當(dāng)它們形成復(fù)合體時(shí)，可催化某一特定的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，如丙酮酸氧化脫羧酶復(fù)合體，含三個(gè)酶六個(gè)輔助因子；脂肪酸合成酶復(fù)合體，含有六個(gè)酶及一個(gè)非酶蛋白質(zhì)。(三)根據(jù)酶的存在狀態(tài)分為：胞內(nèi)酶、胞外酶1.胞內(nèi)酶：在合成分泌后定位于細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用的酶，大多數(shù)的酶屬于此類。2.胞外酶：在合成后分泌到細(xì)胞外發(fā)生作用的酶，主要為水解酶。三.酶催化作用的特性（一）酶與普通催化劑的共性：1.只能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)，對于可逆反應(yīng)，酶只能縮短反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間，但不改變平衡常數(shù)；2.酶也是通過降低化學(xué)反應(yīng)的活化能來加快反應(yīng)速度；3.酶在反應(yīng)中用量很少，反應(yīng)前后數(shù)量、性質(zhì)不變。（二）酶催化作用的特性：指酶不同于一般的催化劑的性質(zhì)。1、高度專一性：酶的專一性：也稱為酶的特異性(specificity)，它是指酶對所作用底物(substrate)的選擇性。根據(jù)酶對底物的選擇方式不同，酶的專一性分為：（1）、絕對專一性(absolutespecificity)：指一種酶只選擇一種底物作用，如脲酶。（2）、相對專一性(relativespecificity)：指一種酶選擇一類底物作用。根據(jù)酶選擇的對象不同又分為：鍵專一性(bondspecificity)：指酶對所作用鍵的選擇性，如脂肪酶?；鶊F(tuán)專一性（族專一性,groupspeicificity）：指酶對所作用的鍵及鍵一側(cè)的基團(tuán)的選擇性，如α-D-葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。（3）、光學(xué)專一性(opticalspecificity)：指酶對所作用底物立體構(gòu)型的選擇性，如L-氨基酸氧化酶。（4）、幾何專一性(geometricalspecificity)：指酶對所作用底物順反異構(gòu)的選擇性，如順烏頭酸酶。2、高效性：酶比一般的普通催化劑效率高106-1013倍。3、反應(yīng)條件溫和4、易變性5、酶的活力（activity）受多種因素的調(diào)節(jié)與控制四、酶的命名與分類（一）酶的命名：通常采用習(xí)慣命名法，主要根據(jù)以下幾個(gè)原則：1、根據(jù)酶作用的底物來命名：如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等；2、根據(jù)酶催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名：如脫氫酶、脫羧酶、水解酶等；3、根據(jù)酶的來源、作用條件等來命名：如細(xì)菌淀粉酶、堿性磷酸酯酶、胃蛋白酶等。從上述可知，酶的習(xí)慣命名法不夠系統(tǒng)，不夠準(zhǔn)確，難免會出現(xiàn)一酶多名或一名多酶的現(xiàn)象。為此1961年國際酶學(xué)委員會（EnzymeCommission，EC）提出了系統(tǒng)命名法，系統(tǒng)命名法規(guī)定，酶的名稱包括兩部分：底物名稱和反應(yīng)類型，如果反應(yīng)中有多個(gè)底物，每個(gè)底物均需列出（水解反應(yīng)中的水可省略），底物名稱之間用“：”隔開。若底物有構(gòu)型，也需標(biāo)出，如L—丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶。(二)、酶的系統(tǒng)分類方法：根據(jù)酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)，由酶學(xué)委員會規(guī)定，將酶分為六大類：1.

氧化還原酶類催化底物的氧化還原反應(yīng)，如脫氫酶、氧化酶等。2.

轉(zhuǎn)移酶類催化底物之間基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，如氨基轉(zhuǎn)移酶、激酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、羧基轉(zhuǎn)移酶等。3.

水解酶類催化底物的水解反應(yīng)，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、淀粉酶等。4.

裂合酶類催化底物裂解或縮合反應(yīng)，如脫水酶、脫氨酶、脫羧酶、醛縮酶等。5.

異構(gòu)酶類催化同分異構(gòu)體的底物之間相互轉(zhuǎn)換，如磷酸甘油酸變位酶、磷酸己糖異構(gòu)酶。6.

合成酶類也稱連接酶類，催化兩種或兩種以上化合物合成一種化合物的反應(yīng)。反應(yīng)需吸收能量，通常與ATP的分解相偶連，ATP分解產(chǎn)生能量用于合成反應(yīng)。（三）酶的系統(tǒng)編號：根據(jù)上述酶的系統(tǒng)分類方法，國際酶學(xué)委員會還對每個(gè)酶做了統(tǒng)一編號，一個(gè)酶只有一個(gè)編號，因此不會混淆。酶的系統(tǒng)編號由“EC”加四個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字組成，每個(gè)數(shù)字之間以“.”隔開?！癊C”是國際酶學(xué)委員會的縮寫，這四個(gè)數(shù)字的含義分別是：第一個(gè)數(shù)字代表大類，第二個(gè)數(shù)字代表亞類，第三個(gè)數(shù)字是亞亞類，第四個(gè)數(shù)字是酶在亞亞類中的序號。如：EC1.1.1.27（乳酸：NAD+氧化還原酶）。第二節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、酶的活性中心與必需基團(tuán)（一）酶的活性中心酶是生物大分子，相對分子質(zhì)量很大，而與酶反應(yīng)的底物一般是相對分子質(zhì)量較小的分子，有時(shí)即使是大分子底物時(shí)，反應(yīng)也是逐步進(jìn)行的，酶僅與大分子底物中的一小部分作用。與底物接觸并且發(fā)生反應(yīng)的部位就稱為酶的活性中心(activecenter)。酶的活性中心往往是若干個(gè)在一級結(jié)構(gòu)上相距很遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近的氨基酸殘基集中在一起形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，該區(qū)域與底物相結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，對于結(jié)合酶來說，輔酶或輔基往往是活性中心的組成成分。酶的活力中心通常包括兩部分：與底物結(jié)合的部位稱為結(jié)合中心，結(jié)合中心決定酶的專一性；促進(jìn)底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化中心，它決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)以及催化的效率。有些酶的結(jié)合中心與催化中心是同一部分。酶活性中心示意圖（二）酶的必需基團(tuán)(essentialgroup)酶的分子中存在著許多功能基團(tuán)，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是這些基團(tuán)都與酶活性有關(guān)。一般將與酶活性有關(guān)的基團(tuán)稱為酶的必需基團(tuán)。必需基團(tuán)可分為四種：1.

接觸殘基（contactresidue）：直接與底物接觸的基團(tuán)，它們參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變，是活性中心的主要必需基團(tuán)。這些基團(tuán)中有的與底物結(jié)合稱為結(jié)合基團(tuán)(bindinggroup)，有的催化底物發(fā)生化學(xué)變化稱為催化基團(tuán)(catalyticgroup)?；钚灾行闹杏械谋匦杌鶊F(tuán)可同時(shí)具有這兩方面的功能。還有些必需基團(tuán)雖然不參加酶的活性中心的組成，但為維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需，這些基團(tuán)是酶的活性中心以外的必需基團(tuán)。2.

輔助殘基(auxiliaryresidue):這種殘基既不直接與底物結(jié)合，也不催化底物的化學(xué)反應(yīng)，但對接觸殘基的功能有促進(jìn)作用。它可促進(jìn)結(jié)合基團(tuán)對底物的結(jié)合，促進(jìn)催化基團(tuán)對底物的催化反應(yīng)。它也是活性中心不可缺少的組成部分。3.

結(jié)構(gòu)殘基（structureresidue）：這是活性中心以外的必需基團(tuán)，它們與酶的活性不發(fā)生直接關(guān)系，但它們可穩(wěn)定酶的分子構(gòu)象，特別是穩(wěn)定酶活性中心的構(gòu)象，因而對酶的活性也是不可缺少的基團(tuán)，只是起間接作用而已。4.

非貢獻(xiàn)殘基（noncontributionresidue）：酶分子中除上述基團(tuán)外的其它基團(tuán)，它們對酶的活性“沒有貢獻(xiàn)”，也稱為非必需基團(tuán)。這些基團(tuán)對酶活性的發(fā)揮不起作用，它們可以被其他氨基酸殘基取代，甚至可以去掉都不會影響酶的催化活力。但這些基團(tuán)并不是真正意義上的“非必需”基團(tuán)，它們可能在系統(tǒng)發(fā)育的物種專一性方面、免疫方面或者在體內(nèi)的運(yùn)輸轉(zhuǎn)移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果沒有這些基團(tuán)，酶的壽命、酶在細(xì)胞中的分布等方面受到限制。這些基團(tuán)的存在也可能是該酶迄今未發(fā)現(xiàn)的新的活力類型的活力中心。（三）.酶活性中心證明方法1.切除法對小分子且結(jié)構(gòu)已知的酶多用此法。用專一性的酶切除一段肽鏈后剩余的肽鏈仍有活性，說明切除的肽鏈與活性無關(guān)，反之，切除的肽鏈與活性有關(guān)。2.化學(xué)修飾法選用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑與酶蛋白中的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)引起共價(jià)結(jié)合、氧化或還原等修飾，稱之為化學(xué)修飾。酶分子中可以修飾的基團(tuán)有：-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修飾的試劑很多，目前已有七十多種，但專一性的修飾劑不多。判斷方法：某一基團(tuán)被修飾后，酶的活性顯著下降或無活性，可初步判斷該基團(tuán)與酶的活性有關(guān)；反之，與酶的活性無關(guān)。缺點(diǎn)：也有可能酶活性部位外的某個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈的修飾而影響酶分子的正常空間結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致酶活性的喪失。為排除這種可能，常在底物保護(hù)下用同一試劑對酶作用，若不能被修飾，說明該基團(tuán)確實(shí)處于活性部位；反之，底物存在下，該基團(tuán)可被同一試劑修飾，且使酶失活，在則該基團(tuán)不是活性部位的基團(tuán)，而是結(jié)構(gòu)基團(tuán)。根據(jù)修飾劑是否專一性結(jié)合酶的活性中心的特定基團(tuán)，化學(xué)修飾可分為：（1）、非特異性共價(jià)共接修飾：修飾試劑既可與酶的活性部位的某特異基團(tuán)結(jié)合，又可與酶的非活性部位的同一基團(tuán)結(jié)合，稱之為非特異性共價(jià)共價(jià)修飾。此法適用于所修飾的基團(tuán)只存在與活性部位，在非活性部位不存在或極少存在。判斷標(biāo)準(zhǔn)是一：酶活力的喪失程度與修飾劑的濃度成正比；二：底物或競爭性抑制劑保護(hù)下可防止修飾劑的抑制作用。（2）、特異性的共價(jià)修飾：修飾劑專一性地結(jié)合于酶的活性部位的特定基團(tuán)，使酶失活。如：DIFP（二異丙基氟磷酸）可專一性地結(jié)合絲氨酸蛋白酶活性部位的絲氨酸—OH而使酶失活。DIFP一般不與蛋白質(zhì)反應(yīng)，也不與含絲氨酸的蛋白酶原或變性的酶反應(yīng)，只與活性的酶且活性部位含絲氨酸的酶結(jié)合。3.親和標(biāo)記法：根據(jù)酶與底物能特異性的結(jié)合的性質(zhì)，設(shè)計(jì)合成一種含反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物，作為活性部位的標(biāo)記試劑，它能象底物一樣進(jìn)入酶的活性部位，并以其活潑的化學(xué)基團(tuán)與酶的活性基團(tuán)的某些特定基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最適底物為：N—對甲苯磺?！狶—苯丙氨酰乙酯或甲酯，根據(jù)此結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的親和標(biāo)記試劑為：N—對甲苯磺?！奖滨Ｂ燃谆═PCK）。4.X—射線衍射法：把一純酶的X—射線晶體衍射圖譜與酶與底物反應(yīng)后的X-射線圖譜相比較，即可確定酶的活性中心。(四)酶的活性中心的一級結(jié)構(gòu)應(yīng)用化學(xué)修飾法對多種酶的活性中心進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在酶的活性中心處存在頻率最高的氨基酸殘基是：絲氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、賴氨酸和半胱氨酸。如果用同位素標(biāo)記酶的活性中心后，將酶水解，分離帶標(biāo)記水解片段，對其進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)測定，就可了解酶的活性中心的一級結(jié)構(gòu)。對各種蛋白水解酶進(jìn)行類似的分析，功能類似的酶在一級結(jié)構(gòu)上有驚人的相似性。見下表所示：酶氨基酸順序胰蛋白酶（牛）胰凝乳蛋白酶（牛）彈性蛋白酶（豬）凝血酶（牛）蛋白酶（S.griseus）—天冬.絲,半胱.谷酰胺.甘.天冬.絲.甘.甘.脯.纈--絲.絲.半胱.甲硫.甘.天冬.絲.甘.甘.脯.亮--絲.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.絲.甘.甘.脯.亮--天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.絲.甘.甘.脯.苯丙-蘇.半胱.谷.甘.天冬.絲.甘.甘.脯.甲硫

從上表可知，一些絲氨酸蛋白酶在活性絲氨酸附近的氨基酸幾乎完全一樣，而且這個(gè)活性絲氨酸最鄰近的5-6氨基酸順序，從微生物到哺乳動物都一樣，說明蛋白質(zhì)活性中心在種系進(jìn)化上有嚴(yán)格的保守性。二、酶的活性與高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系酶的活性不僅與一級結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與其高級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。就某種程度而言，在酶的活性表現(xiàn)上，高級結(jié)構(gòu)甚至比一級結(jié)構(gòu)更為重要。高級結(jié)構(gòu)是形成酶特定空間結(jié)構(gòu)的保證，高級結(jié)構(gòu)破壞，酶失去活性。三、酶原激活有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成時(shí)，或初分泌時(shí)，沒有催化活性，這種無活性狀態(tài)的酶的前體稱為酶原(zymogen)。酶原向活性的酶轉(zhuǎn)化的過程稱為酶原的激活。酶原激活實(shí)際上是酶的活性中心形成或暴露的過程。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、彈性蛋白酶在它們初分泌時(shí)都是以無活性的酶原形式存在，在一定條件下才轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酶。某些酶原的激活過程酶原激活條件活化的酶水解掉的肽段胃蛋白酶原胃蛋白酶六肽胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽糜蛋白酶原Aα-糜蛋白酶兩個(gè)二肽羧肽酶原A羧肽酶A幾個(gè)碎片彈性蛋白酶原彈性蛋白酶幾個(gè)碎片例如，胰蛋白酶原進(jìn)入小腸后，受腸激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位賴氨酸與第7位異亮氨酸殘基之間的肽鍵被切斷，水解掉一個(gè)六肽，酶分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原變成了有活性的胰蛋白酶。除消化道的蛋白酶外，血液中有關(guān)凝血和纖維蛋白溶解的酶類，也都以酶原的形式存在。胰蛋白酶原激活示意圖糜蛋白酶原的激活過程胃蛋白酶原的激活過程

胃蛋白酶原的激活過程酶原激活的生理意義在于避免細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并可使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝的正常進(jìn)行。酶催化機(jī)理酶的催化機(jī)理是解釋酶催化特性的理論，如：酶為什么能催化化學(xué)反應(yīng)、酶是如何催化化學(xué)反應(yīng)的、酶為什么有專一性、酶為什么有高效性等。一、酶為什么能催化化學(xué)反應(yīng)一個(gè)化學(xué)反應(yīng)要能夠發(fā)生，關(guān)鍵的是反應(yīng)體系中的分子必須具備一定能量即分子處于活化狀態(tài)，活化分子比一般分子多含的能量就稱為活化能。反應(yīng)體系中活化分子越多，反應(yīng)就越快。因此，設(shè)法增加活化分子數(shù)量，是加快化學(xué)反應(yīng)的唯一途徑。增加反應(yīng)體系的活化分子數(shù)有兩條途徑:一是向反應(yīng)體系中加入能量，如通過加熱、加壓、光照等，另一途徑是降低反應(yīng)活化能。酶的作用就在于降低化學(xué)反應(yīng)活化能，下圖1所示圖1非催化過程和催化過程自由能的變化二、酶如何降低化學(xué)反應(yīng)的活化能中間產(chǎn)物學(xué)說中間產(chǎn)物學(xué)說認(rèn)為：酶在催化化學(xué)反應(yīng)時(shí)，酶與底物首先形成不穩(wěn)定的中間物，然后分解酶與產(chǎn)物。即酶將原來活化能很高的反應(yīng)分成兩個(gè)活化能較低的反應(yīng)來進(jìn)行，因而加快了反應(yīng)速度。S+E→ES→P+E底物酶中間產(chǎn)物產(chǎn)物中間產(chǎn)物學(xué)說已經(jīng)得到一些可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。如，用吸光法證明了含鐵卟啉的過氧化物酶參加反應(yīng)時(shí)，單純的酶的吸收光譜與加入了第一個(gè)底物H2O2后確實(shí)產(chǎn)生了變化。三、酶的高效性的解釋1、底物與酶的鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)2、底物分子的形變和扭曲3、共價(jià)催化4、酸堿催化5、活性部位的微環(huán)境的影響四、酶的專一性的解釋（一）鎖與鑰匙學(xué)說：如圖所示鎖與鑰匙學(xué)說示意圖（二）誘導(dǎo)契合理論如下圖所示（三）結(jié)構(gòu)性質(zhì)互補(bǔ)假說該學(xué)說認(rèn)為酶同底物結(jié)合的專一性，與底物結(jié)構(gòu)和酶的活性中心的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)，二者的結(jié)構(gòu)是互補(bǔ)的。如果底物是解離的，則酶的活性中心的空間結(jié)構(gòu)必然帶相反的電荷才能很好結(jié)合。而且底物同酶活性中心的極性也必然相同。第四節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué)(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。這些因素主要包括酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。一、底物濃度對反應(yīng)速度的影響底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響是在酶的濃度一定的條件下測定的，底物濃度對反應(yīng)速度影響呈現(xiàn)矩形雙曲線(rectangularhyperbola)。底物濃度對反應(yīng)初速度的影響在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級反應(yīng)。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。此時(shí)，無論底物濃度增加多大，反應(yīng)速度也不再增加，說明酶已被底物所飽和。所有的酶都有飽和現(xiàn)象，只是達(dá)到飽和時(shí)所需底物濃度各不相同而已。(一)米氏方程

Vmax指該酶促反應(yīng)的最大速度，[S]為底物濃度，Km是米氏常數(shù)，VO是在某一底物濃度時(shí)相應(yīng)的反應(yīng)速度。當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，[S]《Km,則V≌Vmax[S]/Km，反應(yīng)速度與底物濃度呈正比。當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)，[S]》Km，此時(shí)V≌Vmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，底物濃度再增高也不影響反應(yīng)速度。(二)米氏常數(shù)的意義1.物理意義：Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。2.Km值愈大，酶與底物的親和力愈小；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。3.Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km值也不同。各種酶的Km值范圍很廣，大致在10-1～10-6M(三)Km在實(shí)際應(yīng)用中的重要意義1.鑒定酶：通過測定可以鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶。2.判斷酶的最佳底物：如果一種酶可作用于多個(gè)底物，就有幾個(gè)Km值，其中Km最小對應(yīng)的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解（Km=28mol/L），也可催化棉子糖水解（Km=350mol/L）,兩者相比，蔗糖為該酶的天然底物。3.計(jì)算一定速度下的底物濃度：如某一反應(yīng)要求的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的99%，則[S]=99Km4.了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平：一般地，體內(nèi)酶的天然底物的[S]體內(nèi)≈Km，如果[S]體內(nèi)《Km，那么VO《Vmax,細(xì)胞中的酶處于“浪費(fèi)“狀態(tài)，反之，[S]體內(nèi)》Km，那么VO≈Vmax，底物濃度失去生理意義，也不符合實(shí)際狀態(tài)。5.判斷反應(yīng)方向或趨勢：催化正逆反應(yīng)的酶，其正逆兩向的反應(yīng)的Km不同，如果正逆反應(yīng)的底物濃度相當(dāng)，則反應(yīng)趨向于Km小對應(yīng)底物的反應(yīng)方向。(四)Km求法：雙倒數(shù)作圖(doublereciprocalplotorLineweaverBurkplot)將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為下列形式：1／VO=Km／Vmax·1／[S]+1／Vmax從下圖可知，1/V0對1/[S]的作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax,，在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。此作圖除用來求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面還有重要價(jià)值。雙倒數(shù)作圖法二、酶濃度的影響在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大大超過酶濃度時(shí)，速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對速度的影響機(jī)理：酶濃度增加，[ES]也增加，而V0=k3[ES]，故反應(yīng)速度增加。三、溫度對酶促反應(yīng)速度的影響酶促反應(yīng)與其它化學(xué)反應(yīng)一樣，隨溫度的增加，反應(yīng)速度加快?；瘜W(xué)反應(yīng)中溫度每增加10℃反應(yīng)速度增加的倍數(shù)稱為溫度系數(shù)Q10。一般的化學(xué)反應(yīng)的Q10為2-3，而酶促反應(yīng)的Q10為1-2。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)對應(yīng)的溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度（optimumtemperatureTm）,.一般動物組織中的酶其最適溫度為35-40℃，植物與微生物中的酶其最適溫度為30-60℃，少數(shù)酶可達(dá)60℃以上，如細(xì)菌淀粉水解酶的最適溫度90℃以上。溫度對酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1.溫度影響反應(yīng)體系中的活化分子數(shù)：溫度增加，活化分子數(shù)增加，反應(yīng)速度增加。2.溫度影響酶的活性：過高的溫度使酶變性失活，反應(yīng)速度下降。最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因?yàn)橐环N酶的最適溫度不是一成不變的，它要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反應(yīng)條件有關(guān)。四、pH對酶促反應(yīng)速度的影響大多數(shù)酶的活性受pH影響顯著，在某一pH下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適pH(optimumpHpHm)。典型的酶速度—pH曲線是較窄的鐘罩型曲線，但有的酶的速度—pH曲線并非一定呈鐘罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度—pH曲線。胃蛋白酶的速度-溫度曲線如下圖。胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲線pH對酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1.pH影響酶和底物的解離:酶的活性基團(tuán)的解離受pH影響，底物有的也能解離，其解離狀態(tài)也受pH的影響，在某一反應(yīng)pH下，二者的解離狀態(tài)最有利于它們的結(jié)合，酶促反應(yīng)表現(xiàn)出最大活力，此pH稱為酶的最適pH；當(dāng)反應(yīng)pH偏離最適pH時(shí)，酶促反應(yīng)速度顯著下降。2.pH影響酶分子的構(gòu)象：過高或過低pH都會影響酶分子活性中心的構(gòu)象，或引起酶的變性失活。動物體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.8，肝精氨酸酶最適pH約為9.8(見下表)。一些酶的最適pH酶最適pH酶最適pH酶最適pH胃蛋白酶1.8過氧化氫酶7.6延胡索酸酶7.8胰蛋白酶7.7精氨酸酶9.8核糖核酸酶7.8最適pH不是酶的特征性常數(shù)，它受底物濃度、緩沖液的種類和濃度以及酶的純度等因素的影響。五.激活劑對酶反應(yīng)速度的影響能使酶活性提高的物質(zhì)，都稱為激活劑(activator)，其中大部分是離子或簡單的有機(jī)化合物。如Mg++是多種激酶和合成酶的激活劑，動物唾液中的α-淀粉酶則受Cl-的激活。通常，酶對激活劑有一定的選擇性，且有一定的濃度要求，一種酶的激活劑對另一種酶來說可能是抑制劑，當(dāng)激活劑的濃度超過一定的范圍時(shí)，它就成為抑制劑。六.抑制劑對反應(yīng)速度的影響凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，不屬于抑制劑。通常抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。（一）不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)不可逆性抑制作用的抑制劑，通常以共價(jià)鍵方式與酶的必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合而使酶喪失活性，按其作用特點(diǎn)，又有專一性及非專一性之分。1.非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團(tuán)作用，不論是必需基團(tuán)與否，皆可共價(jià)結(jié)合，由于其中必需基團(tuán)也被抑制劑結(jié)合，從而導(dǎo)致酶的抑制失活。某些重金屬(Pb++、Cu++、Hg++)及對氯汞苯甲酸等，能與酶分子的巰基進(jìn)行不可逆適合，許多以巰基作為必需基團(tuán)的酶(通稱巰基酶)，會因此而遭受抑制，屬于此種類型。用二巰基丙醇(britishantilewisite,BAL)或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復(fù)活。2.專一性不可逆抑制此屬抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團(tuán)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而抑制酶的活性。有機(jī)磷殺蟲劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷?；豢赡嬉种泼傅幕钚?。當(dāng)膽堿酯酶被有機(jī)磷殺蟲劑抑制后，乙酰膽堿不能及時(shí)分解成乙酸和膽堿，引起乙酰膽堿的積累，使一些以乙酰膽堿為傳導(dǎo)介質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)處于過度興奮狀態(tài)，引起神經(jīng)中毒癥狀。解磷定等藥物可與有機(jī)磷殺蟲劑結(jié)合，使酶和有機(jī)磷殺蟲劑分離而復(fù)活。(二)可逆性抑制(reversibleinhibition)抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，在用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。這類抑制劑大致可分為以下二類。1.競爭性抑制(competitiveinhibition)(1)含義和反應(yīng)式抑制劑I和底物S對游離酶E的結(jié)合有競爭作用，互相排斥，已結(jié)合底物的ES復(fù)合體，不能再結(jié)合I。同樣已結(jié)合抑制劑的EI復(fù)合體，不能再結(jié)合S。（2）特點(diǎn)：A.抑制劑I在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與底物S個(gè)相似，能與底物S競爭酶E分子活性中心的結(jié)合基團(tuán)，因此，抑制作用大小取決于抑制劑與底物的濃度比，加大底物濃度，可使抑制作用減弱甚至消除。例如，丙二酸、蘋果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。B.競爭性抑制劑雙倒數(shù)曲線，如下圖所示：競爭性抑制有競爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑的曲線相交于縱坐標(biāo)I/Vmax處，但橫坐標(biāo)的截距，因競爭性抑制存在變小，說明該抑制作用，并不影響酶促反應(yīng)的最大速度Vmax，而使Km值變大。很多藥物都是酶的競爭性抑制劑。例如磺胺藥與對氨基苯甲酸具有類似的結(jié)構(gòu)，而對氨基苯甲酸、二氫喋呤及谷氨酸是某些細(xì)菌合成二氫葉酸的原料，后者能轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，它是細(xì)菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競爭性抑制劑，進(jìn)而減少細(xì)菌體內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕鲂?甲氧芐氨嘧啶(TMP)能特異地抑制細(xì)菌的二氫葉酸還原為四氫葉酸，故能增強(qiáng)磺胺藥的作用?；前匪幬锏囊志饔?.非競爭性抑制(non-competitiveinhibition)(1)含義和反應(yīng)式抑制劑I和底物S與酶E的結(jié)合完全互不相關(guān)，既不排斥，也不促進(jìn)結(jié)合，抑制劑I可以和酶E結(jié)合生成EI，也可以和ES復(fù)合物結(jié)合生成ESI。底物S和酶E結(jié)合成ES后，仍可與I結(jié)合生成ESI，但一旦形成ESI復(fù)合物，再不能釋放形成產(chǎn)物P。（2）特點(diǎn)：A.I和S在結(jié)構(gòu)上一般無相似之處，I常與酶分子上結(jié)合基團(tuán)以外的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合，這種結(jié)合并不影響底物和酶的結(jié)合，增加底物濃度并不能減少I對酶的抑制程度。B.非競爭性抑制劑的雙倒數(shù)曲線：有非競爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑的曲線相交于橫坐標(biāo)-1/Km處，但縱坐標(biāo)的截距，因競爭性抑制存在變大，說明該抑制作用，并不影響酶促反應(yīng)的Km值，而使Vmax值變小，如下圖所示：非競爭性抑制3.反競爭性抑制（1）含義和反應(yīng)式反競爭性抑制劑必須在酶結(jié)合了底物之后才能與酶與底物的中間產(chǎn)物結(jié)合，該抑制劑與單獨(dú)的酶不結(jié)合。（2）特點(diǎn)：反競爭性抑制劑存在下，Km、Vmax都變小。第五節(jié)酶的分離提純及活力測定一.酶的分離提純(一)酶在細(xì)胞中的分布：胞外酶：水解酶類，易收集，不必破碎細(xì)胞，緩沖液或水浸泡細(xì)胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。胞內(nèi)酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎細(xì)胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存在的細(xì)胞器分離后再破碎該細(xì)胞器，然后將酶用適當(dāng)?shù)木彌_溶液或水抽提。(二)分離材料：動植物原料或微生物的發(fā)酵液。微生物發(fā)酵液是用于分離酶的最常用材料，因?yàn)槲⑸锓N類多，繁殖快，培養(yǎng)時(shí)間短，含酶豐富。由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶或其它生物組織中的酶因含有大量的其它物質(zhì)，所以必須經(jīng)過分離、提純、結(jié)晶等階段才可做實(shí)際應(yīng)用。對于某種酶的具體制備方案，應(yīng)通過了解酶的來源、性質(zhì)及純度需要來確定，無固定的方案。（三）原則：在增加酶得率和純度的同時(shí)，盡可能避免高溫、過酸、過堿、劇烈的震蕩及其它可能使酶喪失活力的一切操作過程。盡最大可能保存酶的活力。（四）分離提純：1.酶的抽提：將酶溶解出來就稱為抽提。胞外酶：固體培養(yǎng)的菌體加水或適當(dāng)緩沖溶液浸泡過濾即可。液體培養(yǎng)的菌體將發(fā)酵液離心分離除去菌體收集離心液即可。胞內(nèi)酶：先破碎細(xì)胞，再用水或適當(dāng)?shù)木彌_溶液抽提。2.酶的純化：純化的關(guān)鍵是維持酶的活性，因?yàn)殡S著酶的逐漸提純，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐漸減少，酶的穩(wěn)定性變差，所以整個(gè)純化過程應(yīng)維持低溫。（1）酶的沉淀方法：與蛋白質(zhì)的沉淀方法相同，常用：A．鹽析法：常用硫酸銨鹽析，有分段鹽析和一次性鹽析兩種方法。B．有機(jī)溶劑沉淀法：用乙醇、丙酮等。應(yīng)低溫操作，溶劑少量分批加入。（2）酶的純化方法：有吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。3.酶的結(jié)晶：純化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：一般在-20℃二.酶活力的測定定性鑒定提取物中某一酶是否存在，一般是根據(jù)此酶引起的化學(xué)反應(yīng)來判斷，如檢驗(yàn)在提取物中是否存在淀粉酶。則用提取物與淀粉反應(yīng)，一段時(shí)間以后，用碘-碘化鉀與反應(yīng)液反應(yīng)，若變藍(lán)，說明提取物無淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。酶活力的測定：實(shí)際上是酶定量測定的方法，酶制劑因含雜質(zhì)多易失活等原因，故不能用稱重或測量體積來定量。（一）酶活力的概念：指酶催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小通常用在一定條件下酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。一定量的酶制劑催化某一化學(xué)反應(yīng)速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，測初速度，多用后者。因?yàn)榉磻?yīng)初期底物過量，底物的減少量不容易測定，而產(chǎn)物從無到有，易測定。（二）酶的活力單位：1961年國際生化協(xié)會酶學(xué)委員會統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位（IU）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度25℃）下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾（μmol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為1標(biāo)準(zhǔn)單位。測定條件：最佳的反應(yīng)條件，如最適的Tm（或25℃）、pHm、[S]》[E]、初速度下。1972年國際生化協(xié)會又推薦一種新單位，即Katal(Kat)單位。規(guī)定：在最適溫度下，每秒鐘能催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化為稱為所需要的酶量定義為1Kat。1Kat=60×106IU.(三)酶的比活力：每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。對固體酶：用活力單位/毫克酶蛋白、或活力單位/毫克酶蛋白氮來表示，對液體酶：用活力單位/毫升酶液來表示。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。（四）、酶活力的測定方法1、分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì)或產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法。2、測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。3、滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。4、熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。5、旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采用其它方法。第六節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)一、變構(gòu)酶與變構(gòu)調(diào)節(jié)（一）概念變構(gòu)酶又稱為別構(gòu)酶，指酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地共價(jià)結(jié)合后，引起酶的構(gòu)象的改變，進(jìn)而改變酶的活性狀態(tài)，酶的這種調(diào)節(jié)作用稱為變構(gòu)調(diào)節(jié)(allostericregulation)，具有變構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱變構(gòu)酶(allostericenzyme)，凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為變構(gòu)劑(effector)。變構(gòu)酶多為寡聚酶，含的亞基數(shù)一般為偶數(shù)；且分子中有催化部位（結(jié)合底物）與調(diào)節(jié)部位（結(jié)合變構(gòu)劑），這兩部位可以在不同的亞基上，或者在同一亞基的兩個(gè)不同部位。（二）、變構(gòu)酶作用特點(diǎn)1、一般變構(gòu)酶分子上有二個(gè)以上的底物結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)?shù)孜锱c一個(gè)亞基上的活性中心結(jié)合后，引起酶分子構(gòu)象的改變，使其它亞基的活性中心與底物的結(jié)合能力發(fā)生改變，或出現(xiàn)正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativeeffect)，或出現(xiàn)負(fù)協(xié)同效應(yīng)（negativecooperativeeffect）。2、正協(xié)同效應(yīng)的變構(gòu)酶其速度—底物濃度曲線呈S形，即底物濃度較低時(shí)，酶活性的增加緩慢，底物濃度高到一定程度后，酶活性顯著加強(qiáng)，最終達(dá)到最大值Vmax。如大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)甲?；福ˋTCase）對底物天冬氨酸的結(jié)合表現(xiàn)為正協(xié)同效應(yīng)。

3、負(fù)協(xié)同效應(yīng)的變構(gòu)酶其速度—底物濃度曲線為類似雙曲線，底物濃度較低時(shí)，酶表現(xiàn)出較大活性，但底物濃度明顯增加時(shí)，其反應(yīng)速度無明顯變化。如3-磷酸甘油醛脫氫酶對NAD+的結(jié)合為負(fù)協(xié)同效應(yīng)，其意義在于無論細(xì)胞內(nèi)酶的底物濃度如何變化，酶始終能以一個(gè)較恒定的速度進(jìn)行以滿足細(xì)胞的基本需要。4、變構(gòu)酶除活性中心外，存在著能與變構(gòu)劑作用的亞基或部位，稱調(diào)節(jié)亞基(或部位)，變構(gòu)劑與調(diào)節(jié)亞基以非共價(jià)鍵特異結(jié)合，可以改變調(diào)節(jié)亞基的構(gòu)象，進(jìn)而改變催化亞基的構(gòu)象，從而改變酶活性。凡使酶活性增強(qiáng)的變構(gòu)劑稱變構(gòu)激活劑(allostericactivitor)，它能使上述S型曲線左移，飽和量的變構(gòu)激活劑可將S形曲線轉(zhuǎn)變?yōu)榫匦坞p曲線。凡使酶活性減弱的變構(gòu)劑稱變構(gòu)抑制劑(allostericinhibitor)，能使S形曲線右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的變構(gòu)抑制劑，而ADP、AMP為其變構(gòu)激活劑。5、由于變構(gòu)酶動力學(xué)不符合米－曼氏酶的動力學(xué)，所以當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大速度一半時(shí)的底物的濃度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。正協(xié)同效應(yīng)的變構(gòu)酶底物活性曲線⊙不加變構(gòu)劑加變構(gòu)激活劑加變構(gòu)抑制劑（三）、生理意義1、在正協(xié)同效應(yīng)的變構(gòu)酶的S形曲線中段，底物濃度稍有降低，酶的活性明顯下降，多酶體系催化的代謝通路可因此而被關(guān)閉；反之，底物濃度稍有升高，則酶活性迅速上升，代謝通路又被打開，因此可以通過細(xì)胞內(nèi)底物濃度的變化來靈敏地控制代謝速度。2、變構(gòu)抑制劑常是代謝通路的終產(chǎn)物，變構(gòu)酶常處于代謝通路的入口，通過反饋抑制，可以及早地調(diào)節(jié)整個(gè)代謝通路，減少不必要的底物消耗。例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP轉(zhuǎn)變成ATP，當(dāng)ATP過多時(shí)，通過變構(gòu)抑制劑ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多時(shí)，則可通過變構(gòu)激活劑AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促進(jìn)糖的分解。隨時(shí)調(diào)節(jié)ATP/ADP的水平，可以維持細(xì)胞內(nèi)能量的正常供應(yīng)。二、共價(jià)調(diào)節(jié)酶1、概念：也稱共價(jià)修飾酶，指一類可在其它酶的作用下其結(jié)構(gòu)通過共價(jià)修飾，使該酶活性發(fā)生改變，這種調(diào)節(jié)稱為共價(jià)修飾調(diào)節(jié)(covalentmodificationregulation)，這類酶稱為共價(jià)修飾酶(prosessingenzyme)。一些酶的巰基發(fā)生可逆的氧化還原修飾，一些酶以共價(jià)鍵與磷酸、腺苷等基團(tuán)的可逆結(jié)合，都會引起酶結(jié)構(gòu)的變化而呈現(xiàn)不同的活性。酶的共價(jià)修飾是體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的另一重要的方式。2、特點(diǎn)：共價(jià)修飾酶通常有活性與非活性兩種形式，兩種形式之間轉(zhuǎn)換的正、逆反應(yīng)是由不同的酶催化產(chǎn)生。如骨骼肌中的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式與低活性的脫磷酸化形式兩種，從脫磷酸化形式轉(zhuǎn)化成磷酸化形式是由磷酸化酶b激酶催化，反之，則是有由磷酸化酶磷酸酶催化.

目前已發(fā)現(xiàn)有幾百種酶被翻譯后都需要進(jìn)行共價(jià)修飾，其中一部分處于分支途徑，對其代謝流量起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶，屬于這種酶促共價(jià)修飾系統(tǒng)。由于這種調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能源，機(jī)制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它們常受激素甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人注目。第七節(jié)重要的酶一、同工酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化學(xué)反應(yīng)相同，酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。這類酶存在于生物的同一種屬或同一個(gè)體的不同組織、甚至同一組織或細(xì)胞中。如乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase,LDH），具有多種分子組成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。

LDH同工酶有組織特異性，LDH1在心肌含量高，而LDH5在肝、骨骼肌含量高。因此，LDH同工酶的相對含量的改變在一定程度上反映了某器官的功能狀態(tài)，臨床上利用這些同工酶在血清中的相對含量的改變作為某臟器病變鑒別診斷的依據(jù)。同工酶也是研究代謝調(diào)節(jié)、分子遺傳、生物進(jìn)化、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化和癌變的有力工具，在酶學(xué)、生物學(xué)、和醫(yī)學(xué)中均占有重要地位。二、固定酶用物理、化學(xué)等方法將水溶性的酶固定到特定的載體上使之成為水不溶性的酶稱之為固定酶或固相酶。三、核酶具有催化活性的酶性RNA稱為核酶。1981-1982年ThomasR.Cech實(shí)驗(yàn)室在研究四膜蟲(Tetrahymenathermophiea)的rRNA前體加工成熟時(shí)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)有催化活力的天然rRNA，起名“ribozyme”（核酶）。隨后，S.Altman和N.R.Pace以及T.R.Cech幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正RNA催化劑。其中L19RNA和核糖核酸酶P的RNA組分具有酶活性是兩個(gè)典型的例子。L19是四膜蟲rRNA前體自我剪接釋放的內(nèi)含子，在自身兩次環(huán)化、開環(huán)反應(yīng)中丟失了19個(gè)核苷酸形成的，故名L19RNA。L19RNA有催化寡聚核苷酸底物進(jìn)行切割和連接反應(yīng)，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。它具有使底物分子加速反應(yīng)且反應(yīng)終了本身不被消耗仍具有催化活性的一般催化劑具有的特性。它對底物還具有專一性，作用C5比U5水解時(shí)快得多，對A5和G5無催化活性；此外，它還符合一般酶的米氏動力學(xué)規(guī)律,并被dC5競爭性抑制。綜上所述，L19是一個(gè)真正的酶。核酶的發(fā)現(xiàn)意義重大，它不僅打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，而且還大大促進(jìn)了有關(guān)生物起源，生物進(jìn)化等問題的進(jìn)一步探討。酶的生產(chǎn)和分離純化所有的生物體在一定的條件下都能產(chǎn)生多種多樣的酶。酶在生物體內(nèi)產(chǎn)生的過程，稱為酶的生物合成。經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作控制，利用細(xì)胞（包括微生物、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞）的生命活動，產(chǎn)生人們所需要的酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。酶的分離純化是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，以獲得符合研究或使用要求的酶的過程。其主要內(nèi)容包括細(xì)胞破碎、酶的提取、離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、結(jié)晶等。酶的生物合成酶是生命活動的產(chǎn)物，又是生命活動必不可缺的條件之一。酶的生物合成主要是RNA和蛋白質(zhì)的生物合成過程。RNA的生物合成———轉(zhuǎn)錄（一）RNA合成的起始1.原核生物啟動子：約55bp,分為起始點(diǎn)（startsite）、結(jié)合部位、識別部位。

起始點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始部位以+1表示，轉(zhuǎn)錄的第1個(gè)核苷酸常為嘌呤G,A。

結(jié)合部位：約6bp組成,是高度保守區(qū),共有序列為5'-TATAAT-3',位于起始點(diǎn)上游-10。因Tm低,DNA易解開雙鏈，為RNA聚合酶提供場所。

識別部位：約6bp組成,在-35處,為高度保守區(qū),序列5'-TTGACA-3',s因子識別此部位。2.真核生物啟動子（以RNApolⅡ?yàn)槔┤鐖D所示

于-25處含AT富集區(qū),共有序列TATAA（TATAbox）

-70處含共有序列CAAT,還含許多其它box,例如GCbox,E-box等。

含增強(qiáng)子(enhancer)和靜息子(silencer)

RNApolⅠ和RNApolⅢ與聚合酶Ⅱ所識別的啟動子差異較大。（二）

鏈的延長

轉(zhuǎn)錄泡：是由DNA雙鏈,RNA聚合酶與新合成的轉(zhuǎn)錄本RNA局部形成的結(jié)構(gòu),它貫穿于延長過程的始終。

過程：在起始階段形成第一個(gè)磷酸二酯鍵后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移動，核苷酸之間以3',5'磷酸二酯鍵相連，合成方向5'→3'，合成的RNA自3'末端逐步延長。合成出的RNA與DNA形成雜交分子,約12bp，因結(jié)合不緊很易脫離。（三）

RNA合成的終止：合成移到終止信號時(shí),酶不滑動,聚合停止,轉(zhuǎn)錄完成。

特點(diǎn)：ρ因子參與的終止：r因子與RNA產(chǎn)物中富含C的部位結(jié)合,并誘使RNA聚合酶構(gòu)象改變停止滑動;ρ因子的解螺旋酶活性,利于RNA產(chǎn)物的釋放。

其它終止方式：GC區(qū)形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)阻礙RNA聚合酶的行進(jìn)，聚U區(qū)使配對不穩(wěn)定,以利于RNA產(chǎn)物的釋放。蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯以mRNA為模板，以各種氨基酸為底物，在核糖核蛋白體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程，稱為翻譯。翻譯是將mRNA分子上的堿基排列次序轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚯逆溕习被崤帕写涡虻倪^程。不同的生物，其蛋白質(zhì)的生物合成過程雖然有些差別，但是基本過程均包括氨基酸活化、肽鏈合成的起始、肽鏈的延伸、肽鏈合成的終止及新生肽鏈的加工等。（一）、蛋白質(zhì)合成的起始１、核糖體激活起始因子（ＩＦ）激活由３０Ｓ，５０Ｓ亞基組成的無活性核糖體（７０Ｓ）。２、起始復(fù)合物的形成３０Ｓ－ＩＦ３復(fù)合物，mＲＮＡ和起始氨基酰tＲＮＡ結(jié)合成起始復(fù)合物。此步需消耗ＧＴＰ。3、５０Ｓ亞基與起始復(fù)合物的結(jié)合起始復(fù)合物與５０Ｓ亞基結(jié)合，則起始因子ＩＦ從３０Ｓ亞基中釋放出來，作用與下一個(gè)核糖體的起始作用。（二）、肽鏈延伸包括結(jié)合，轉(zhuǎn)肽，移位三個(gè)步驟。（三）、肽鏈合成終止在接肽過程中，當(dāng)核糖體沿mＲＮＡ移動到終止密碼子ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ時(shí)，肽鏈合成便自動終止。酶生物合成的調(diào)節(jié)根據(jù)機(jī)體內(nèi)酶的合成對環(huán)境影響的反應(yīng)不同，可分為兩大類：一類是構(gòu)成酶或組成酶；另一類酶，它的合成量受環(huán)境營養(yǎng)條件及細(xì)胞內(nèi)有關(guān)因子的影響，有的隨環(huán)境條件變化酶的合成量增加，稱為誘導(dǎo)酶，相反，酶合成隨環(huán)境條件改變而降低，稱為阻遏酶。概述酶的誘導(dǎo)和阻遏是在調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物阻遏蛋白的作用下，通過操縱基因控制結(jié)構(gòu)基因或基因組的轉(zhuǎn)錄而發(fā)生的。由于經(jīng)濟(jì)的原則，細(xì)菌通常并不合成那些在代謝上無用的酶，因此一些分解代謝的酶類只在有關(guān)的底物或底物類似物存在時(shí)才被誘導(dǎo)合成；而一些合成代謝的酶類在產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物足夠量存在時(shí)，其合成被阻遏。在酶誘導(dǎo)時(shí)，阻遏蛋白與誘導(dǎo)物相結(jié)合，因而失去封閉操縱基因的能力。在酶阻遏時(shí)，原來無活性的阻遏蛋白與輔阻遏物，即各種生物合成途徑的終產(chǎn)物（或產(chǎn)物類似物）相結(jié)合而被活化，從而封閉了操縱基因。（二）誘導(dǎo)機(jī)制在正常條件下，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的β—半乳糖苷酶的量極少，但在培養(yǎng)基中加入乳糖后這種酶的量就大大增加。（三）阻遏機(jī)制酶的阻遏與酶的誘導(dǎo)現(xiàn)象非常相似，可以用一個(gè)統(tǒng)一的理論來解釋。在合成代謝中，產(chǎn)物的積累可反作用于酶的合成，即阻遏。1.

終產(chǎn)物阻遏調(diào)節(jié)在合成代謝中，某些合成產(chǎn)物可作為輔阻遏物與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合，這種結(jié)合使基因關(guān)閉，酶的合成反應(yīng)也因此減慢而停止。這種由于終產(chǎn)物的積累而抑制酶的合成常常被稱為反饋?zhàn)瓒?.

自身阻遏調(diào)節(jié)組氨酸的生物合成是通過10步反應(yīng)完成的，催化這10步反應(yīng)的酶由9個(gè)結(jié)構(gòu)基因決定，這9個(gè)結(jié)構(gòu)基因和一個(gè)操縱基因構(gòu)成組氨酸操縱子。3.

降解物阻遏大腸桿菌在只含乳糖而不含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長，必須經(jīng)過一段生長停頓的時(shí)間，在這段時(shí)間內(nèi)逐漸誘導(dǎo)形成能使乳糖進(jìn)入細(xì)胞的透性酶以及分解乳糖的β—半乳糖苷酶。酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一，是根據(jù)產(chǎn)酶的需要，選育到性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞。優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞應(yīng)具備下列條件：（1）酶的產(chǎn)量高；（2）容易培養(yǎng)和管理；（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定；（4）利于酶產(chǎn)品的分離純化；（5）安全可靠。目前工業(yè)上應(yīng)用的酶都采用微生物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)。酶生產(chǎn)常用微生物菌種的分離篩選（一）常用的產(chǎn)酶微生物現(xiàn)在大多數(shù)酶都采用微生物細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。微生物具有種類多，繁殖快，容易培養(yǎng)代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn)，有不少性能優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株已在菌的發(fā)酵生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)把常用的產(chǎn)酶微生物簡介如下：1.枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)枯單芽抱桿菌是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物之一。枯草桿菌是芽胞桿菌屬細(xì)菌。細(xì)胞成桿狀，大小為0.7~0.8x2~3μm，單個(gè)，無莢膜，周生鞭毛，運(yùn)動，革蘭氏染色陽性。曲落粗糙，不透明，污白色或微帶黃色。此菌用途很廣，可用于生產(chǎn)α—淀粉酶、蛋白酶、β—葡聚糖酶、堿性磷酸酶等。例如，枯草桿菌BF7658是國內(nèi)用于生產(chǎn)α—淀粉酶的主要菌株；枯草桿菌AS1.398可用于生產(chǎn)中性蛋白酶和堿性磷酸酶。枯草桿菌生產(chǎn)的α—淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而堿性磷酸酶存在于細(xì)胞間質(zhì)之中。2.大腸桿菌(Escherichiacoli)大腸桿菌細(xì)胞呈桿狀，大小為0.5×1.0~3.0μm，革蘭氏染色陰性，無芽胞，菌落從白色到黃白色，光滑閑光，擴(kuò)展。大腸桿菌可生產(chǎn)多種多樣的酶，一般都屬于胞內(nèi)酶，需經(jīng)過細(xì)胞破碎才能分離得到。例如，谷氨酸脫羧酶，用于測定谷氨酸含量或生產(chǎn)γ—氨基丁酸；天門冬氨酸酶，催化廷胡素酸加氨生成L—天門冬氨酸；芐青霉素酰化酶，生產(chǎn)新的半合成青霉素或頭孢霉素；β—半乳糖苷酶，用于分解乳糖；限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、核酸外切酶，在基因工程方面應(yīng)用。3.黑曲霉(Aspergillusniger)黑曲霉是曲霉屬黑曲霉群霉菌。菌絲體由具橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，菌叢黑褐色，頂囊球形，小梗雙層，分生胞子球形，平滑或粗糙。黑曲霉可用于生產(chǎn)多種酶，有胞外酶也有胞內(nèi)酶。如，糖化酶、α—淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核搪核酸酶、脂肪酶、纖維素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。4.米曲霉(Aspergillusoryzae)米曲霉是曲霉屬黃曲霉群霉菌。菌叢一般為黃綠色，后變?yōu)辄S褐色，分生袍子頭呈放射形，頂裹囊球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形，平滑少數(shù)有刺，分生孢子梗長2mm左右，粗糙。米曲霉可用于生產(chǎn)糖化酶和蛋白酶，這在我國傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲中得到廣泛應(yīng)用。此外，米曲霉還用于生產(chǎn)氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P1、果膠酶等。5.青霉(Penicillium)青霉屬半知菌綱。營養(yǎng)菌絲無色，淡色，有橫隔，分生孢子枝亦有橫隔，頂端形成掃帚狀的分枝，小梗頂端串生分生孢子，分生孢子球形，橢圓形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生長時(shí)呈藍(lán)綠色。青霉菌分布廣泛，種類很多。其中產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素?；?主要作用于青霉素V)、果膠酶、纖維素酶Cx等；桔青霉(Penicilliumcitrinum)用于生產(chǎn)5’—磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核竣曲Sl、核酸酶P1等．6.木霉(Trichoderma)木霉屬于半知菌綱。生長時(shí)菌落呈棉絮狀或致密叢束狀，菌落表面呈不同程度的綠色。菌絲透明，有分隔，分枝繁復(fù)，分枝末端為小梗，瓶狀，束生、對生、互生或單生，分生孢子由小梗相繼生出，靠粘液把它們聚集成球形或近球形的孢子頭。分生孢子近球形或橢圓形，透明或亮黃綠色。木霉是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。木霉產(chǎn)生的纖維素酶中包含有Cl酶、Cx酶和纖維二糖酶等。此外，木霉中含有較強(qiáng)的l7α羥化酶，常用于甾體轉(zhuǎn)化。7.根霉(Rhizopus)根霉生長時(shí)，由營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的頂端膨大形成孢子囊，囊內(nèi)生孢子囊孢子，孢子呈球形、卵形或不規(guī)則形狀。根霉用于生產(chǎn)糖化酶、α—淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。根霉有強(qiáng)的ll—α羥化酶，是用于甾體轉(zhuǎn)化的重要菌株。8.毛霉(Mucor)毛霉的菌絲體在基質(zhì)上或基質(zhì)內(nèi)廣泛蔓延，苗絲體上直接生山孢子囊梗，分枝較小或單生，孢子囊梗頂端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常帶有針狀的草酸鈣結(jié)晶。毛霉用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。9.鏈霉菌(Streptomyces)鏈霉菌是一種放線菌。形成分校的菌絲體。有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲之分，基內(nèi)菌絲體不斷裂，只有氣生茵絲體形成孢子鏈。鏈霉菌是生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的主要菌株，還可以用于生產(chǎn)青霉素?；浮⒗w維素酶、堿性蛋白面、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。此外，鏈霉菌還含有豐富的16α羥化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化。10.啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)啤灑酵母是在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的酵母，細(xì)胞由圓形、卵形、橢圓形到臘腸形。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落為白色，有光澤，平滑，邊緣整齊。營養(yǎng)細(xì)胞可以直接變?yōu)樽幽?，每個(gè)子囊含有l(wèi)~4個(gè)圓形光亮的子囊孢子。啤酒酵母主要用于釀造啤酒、酒精、飲料酒和面包制造。在酶的生產(chǎn)方面，用于轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等的生產(chǎn)。11.假絲酵母(Candida)假絲酵母的細(xì)胞圓形、卵形或長形。無性繁殖為多邊芽殖，形成假菌絲，可生成厚垣孢子、無節(jié)孢子、子囊孢子。不產(chǎn)生色素。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈乳白色或奶油色。假絲酵母是單細(xì)胞蛋白的主要生產(chǎn)菌。在酶工程方面可用于生產(chǎn)脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶。假絲酵母具有烷類代謝的酶系，可用于石油發(fā)酵；具有較強(qiáng)的17羥基化酶，可用于甾體轉(zhuǎn)化制造睪丸素等。菌種的分離篩選與遺傳育種菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。優(yōu)良菌種不僅能提高酶制劑產(chǎn)量、發(fā)酵原料的利用效率，而且還與增加品種，縮短生產(chǎn)周期，改進(jìn)發(fā)酵和提煉工藝等密切相關(guān)。自然界是生產(chǎn)菌種的主要來源；但直接分離得到的往往不能立即用于生產(chǎn)，還需經(jīng)過一系列的遺傳育種步驟。優(yōu)良菌種的性狀也不是固定不變的，因此在使用過程中要建立科學(xué)的管理制度和保藏方法，防止菌種的污染和退化。從自然界分離篩選（1）含菌樣品的采集；（2）富集培養(yǎng)；（3）菌種純化：稀釋法和劃線法。菌種變異（1）用物理或化學(xué)方法誘變（2）用基因操作技術(shù)提高菌種的產(chǎn)酶能力酶的發(fā)酵工藝條件及控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)是以獲得大量所需的酶為目的。為此，除了選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞以外，還必須滿足細(xì)胞生長、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的各種工藝條件，并要根據(jù)發(fā)酵過程的變化進(jìn)行優(yōu)化控制?；罨c擴(kuò)大培養(yǎng)性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞選育出來以后，必須盡可能保持其生長和產(chǎn)酶特性不變異，不死亡，不被雜菌污染等。保藏細(xì)胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動能力，這就叫做細(xì)胞活化。（二）培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基有多種多樣，千差萬別。但培養(yǎng)基的組分一般包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因素等幾方面。1．碳源碳源是指能夠向細(xì)胞提供碳素化合物物的營養(yǎng)物質(zhì)。通常碳源同時(shí)也是提供能量的能源。在選擇碳源時(shí)，必須考慮原科的供求和價(jià)格問題。目前，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如：糊精、麥芽糖、葡萄糖等。2．氮源氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要功組成元素。凡能夠向細(xì)胞提供氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為氮源。氮源可分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種。有機(jī)氮源主要是各種蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物。無機(jī)氮源是含氮的各種無機(jī)化合構(gòu)。此外，碳和氮兩者的比例對酶的產(chǎn)量有顯著的影響。所謂碳氮比(C／N)一般是指培養(yǎng)基中碳元素(C)的總量與氮元素(N)總量之比?？赏ㄟ^測定或計(jì)算培養(yǎng)基中碳和氮的含量而求出。有時(shí)也采用培養(yǎng)基中碳源總量和氮源總量之比來表示碳氮比。–使用時(shí)要注意兩種比值是不同的。3．無機(jī)鹽無機(jī)鹽的主要作用是提供細(xì)胞生命活動不可缺少的無機(jī)元素，并對培養(yǎng)基的pH值、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細(xì)胞對無機(jī)元素需要量的大小，可分為主要元素(大量元素)和微量元素兩大類。主要元素有：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣等。微量元素有：銅、錳、鋅、鉬、鈷、碘等。微量元素是細(xì)胞生命活動不可缺少的，但需要量很少，過量反而會引起不良效果，必須嚴(yán)加控制。4．生長因素生長因素是指細(xì)胞生長繁殖所必不可缺的微量有機(jī)化合物，主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素，以及動植物生長激素等。pH值的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值與細(xì)胞的生長繁殖以及發(fā)酵產(chǎn)酶都有密切關(guān)系，故必須進(jìn)行必要的調(diào)節(jié)控制。不同細(xì)胞生長繁殖的最適pH值有所不同。一般細(xì)菌和放線菌的生長最適pH值為中性或微堿性（pH6.5~8.0)；霉菌和酵母的生長最適pH值為偏酸性(pH4.0~6.0)；植物細(xì)胞生長的最適pH值為5~6。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值通常接近于該酶反應(yīng)的最適pH值。所以在細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，必須對培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂坪驼{(diào)節(jié)。pH值的調(diào)節(jié)可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其比例來實(shí)現(xiàn)。必要時(shí)可使用緩沖溶液，或添加適宜的酸、堿溶液，以調(diào)節(jié)控制培養(yǎng)基中pH值的變化。（四）溫度的調(diào)節(jié)控制溫度是影響細(xì)胞生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。不同的細(xì)胞有各自不同的最適生長溫度。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與最適生長溫度有所不同，而月往往低于最適生長溫度，這是由于在較低的溫度條件下，可提高酶的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞產(chǎn)酶時(shí)間。在細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶過得中，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，不斷放出熱量，會使培養(yǎng)基的溫度升高，同時(shí)，熱量不斷擴(kuò)散和散失，又會使培養(yǎng)基溫度降低，兩者綜合，決定了培養(yǎng)基的溫度．–溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設(shè)計(jì)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。（五）溶解氧的調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的生長繁殖以及酶的生物合成過程需要大量的能量。為了滿足細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要，培養(yǎng)基中的能源物質(zhì)(一般是碳源提供)必須經(jīng)有氧降解才能產(chǎn)生大量的ATP。為此，必須供給充足的氧氣。在培養(yǎng)基中生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的細(xì)胞，一般只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧氣——溶解氧。由于氧是難溶于水的氣體，培養(yǎng)基中含有的溶解氧并不多，很快就會被細(xì)胞利用完。為此，必須在發(fā)酵過程中連續(xù)不斷地供給無菌空氣，使培養(yǎng)基中的溶解氧保持在一定水平，以滿足細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的需要。調(diào)節(jié)溶氧速率的方法，主要有下列幾種：(1)調(diào)節(jié)通氣量(2)調(diào)節(jié)氧的分壓：(3)調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間：(4)調(diào)節(jié)氣液接觸面積(5)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液粘度（六）提高酶產(chǎn)量的措施在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，為了提高酶產(chǎn)量，除了選育優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，保證發(fā)酵工藝條件并根據(jù)需要和變化情況及時(shí)加以調(diào)節(jié)控制以外，還可以來取某些行之有效的措施，諸如添加誘導(dǎo)物，控制阻遏物濃度，添加表面活性劑或其他產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。1.添加誘導(dǎo)物對于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，可使產(chǎn)酶量顯著提高。誘導(dǎo)物一般可分為3類：(1)酶的作用底物(2)酶的反應(yīng)產(chǎn)物(3)酶的底物類似物2.控制阻遏物濃度如前所述，有些酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用。為了提高酶產(chǎn)量，必須設(shè)法解除阻遏作用。阻遏作用有產(chǎn)物阻退和分解代謝物阻遏兩種。阻遏物可以是酶催化反應(yīng)產(chǎn)物，代謝途徑的末端產(chǎn)物以及分解代謝物(葡萄糖等容易利用的碳源)。控制阻遏物濃度是解除阻遏、提高梅產(chǎn)量的有效措施。3．添加表面活性劑表面活性劑可分為離子型和非離子型兩大類。離子型表面活性劑又有陽離子型．陰離子型和兩性離子型之別。由于離子型表面活性劑有些對細(xì)胞有毒害作用，特別是季胺型離子表面活性劑(如“新潔而滅”等)是消毒劑。不能用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)。4．添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但作用機(jī)理并未闡明清楚的物質(zhì)。添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑往往對提高酶產(chǎn)量有顯著效果。動、植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶利用植物細(xì)胞和動物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)各種天然產(chǎn)物，是生物工程研究和開發(fā)的新領(lǐng)域。動物細(xì)胞和植物細(xì)胞均可以在人工控制條件的生物反應(yīng)器中，如同微生物細(xì)胞那樣，發(fā)酵生產(chǎn)而獲得各種所需的產(chǎn)物。微生物、植物、動物細(xì)胞之間有不同的特性。植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶1.發(fā)酵的特點(diǎn)–植物細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)首先從植物組織中選育出植物細(xì)胞，再經(jīng)過篩選、誘變、原生質(zhì)體融合或DNA重組等技術(shù)而獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定的植物細(xì)胞。然后，用植物細(xì)胞在人工控制條件的植物細(xì)胞反應(yīng)器中，如同微生物細(xì)胞那樣，進(jìn)行發(fā)酵而獲得各種所需的產(chǎn)物。植物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物與從植物中提取分離這些物質(zhì)相比較，具有如下特點(diǎn)：1．提高產(chǎn)率使用高產(chǎn)穩(wěn)定的植物細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，可明顯提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)率。2．縮短周期3．易于管理，減輕勞動強(qiáng)度4．提高產(chǎn)品質(zhì)量2.植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制（1）植物細(xì)胞生長和發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基（2）溫度和pH值（3）通風(fēng)與攪拌（4）前體的添加（5）刺激劑的應(yīng)用動物細(xì)胞發(fā)酵動物細(xì)胞可以產(chǎn)生各種有較高價(jià)值的物質(zhì)。特別是激素、疫苗、單克隆抗體和酶等各種動物功能蛋白質(zhì)，通過動物細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵得到的動物功能蛋白主要有如下幾種：1.疫苗：脊髓灰質(zhì)炎(小兒麻痹癥)疫苗，牲畜口蹄疫疫苗，風(fēng)疹疫苗，麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，黃熱病疫苗，狂犬病疫苗，肝炎疫苗等。2.激素：催乳激素，生長激素，前列腺素，促性腺激素，淋巴細(xì)胞活素，白細(xì)胞間質(zhì)素，干擾素，胰島素等。3.酶：膠原酶，血纖維蛋白溶酶原活性劑等。4.單克隆抗體：通過雜交瘤細(xì)胞等動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)各種單克隆抗體。動物細(xì)胞培養(yǎng)方法可分成兩大類。一類是來自血液、淋巴組織的細(xì)胞、腫癌細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞等，可以采用懸浮培養(yǎng)。另一類是存在于動物復(fù)雜的器官中的細(xì)胞，與其周圍的細(xì)胞互相依存，即有所謂“定位依存’關(guān)系，這一類細(xì)胞不宜采用懸浮培養(yǎng)，而必須依附在固體或半固體的表面才能生長和進(jìn)行正常的新陳代謝。定位依存關(guān)系的細(xì)胞一般采用固定化細(xì)胞培養(yǎng)方式。動物細(xì)胞的固定化宜采用吸附法或包理法。酶的分離純化酶的分離純化是酶工程的主要內(nèi)容，也是酶學(xué)研究過程中必不可少的環(huán)節(jié)。酶的分離純化是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，以獲得符合研究或使用要求的酶的過程。其主要內(nèi)容包括細(xì)胞破碎、酶的提取、離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、結(jié)晶等。細(xì)胞破碎酶的種類繁多，已知的約4000種，它們存在于不同生物體的不同部位。除了動物和植物體液中的酶和微生物胞外酶之外，大多數(shù)酶都存在于細(xì)胞之中。為了獲得細(xì)胞內(nèi)的酶，就得收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞或組織破碎。對于不同的生物體，或同一生物體的不同組織的細(xì)胞，由于結(jié)構(gòu)不同，所采用的細(xì)胞破碎方法和條件亦有所不同，必須根據(jù)具體情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，以達(dá)到預(yù)期的效果。細(xì)胞破碎的方法很多，可以分為機(jī)械破碎法、微量破碎法、化學(xué)破碎法和酶促破碎法等。機(jī)械破碎法通過機(jī)械運(yùn)動所產(chǎn)生的剪切力的作用使細(xì)胞破碎的方法，稱為機(jī)械破碎法。常用的破碎機(jī)械有：（1）組織搗碎機(jī)（2）細(xì)胞研磨器（3）勻漿器物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細(xì)胞的破碎。常用的物理破碎法方法有：（1）溫度差破碎法：利用溫度的突然變化，細(xì)胞由于熱脹冷縮的作用而破碎。（2）壓力差破碎法：通過壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎。常用的有高壓沖擊、突然降壓及滲透壓變化等方法。（3）超聲波破碎法：利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的10~20kHz的聲波或超聲波的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴作用（cavitation）而使細(xì)胞破碎。化學(xué)破碎法通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用使細(xì)胞破碎的方法，稱為化學(xué)破碎法。–常用的化學(xué)試劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機(jī)溶劑和特里頓（Triton）、吐溫（Tween）等表面活性劑。–有機(jī)溶劑處理–表面活性劑處理酶學(xué)破碎法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的目的。–利用細(xì)胞本身的酶系的作用，在一定的pH值和溫度條件下保溫一段時(shí)間，使細(xì)胞破壞，而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法，稱為自溶法。自溶法效果的好壞取決于溫度、pH值、離子強(qiáng)度等自溶條件的選擇與控制。–根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，還可以外加適當(dāng)?shù)拿缸饔糜诩?xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞，并在低滲透壓的溶液中使細(xì)胞破裂。例如，革蘭氏陽性菌主要依靠肽多糖維持細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和形狀，外加溶菌酶，作用于肽多糖的β-1，4-糖苷鍵，而使其細(xì)胞壁破壞；酵母細(xì)胞的破碎是外加!-葡聚糖酶，使其細(xì)胞壁的β-1，3-葡聚糖水解；霉菌可用幾丁質(zhì)酶機(jī)械細(xì)胞破碎；纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的混合使用，對植物細(xì)胞壁有良好的破碎效果。酶的提取酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。酶都能溶解于水，可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取。有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中要注意控制好溫度、pH值等提取條件。根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。酶提取的主要方法1.鹽溶液提取大多數(shù)蛋白類酶（P-酶）都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象，所以一般采用稀鹽溶液進(jìn)行酶的提取。例如，固體發(fā)酵生產(chǎn)的麩曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，用0.14mol/L的氯化鈉溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸緩沖液提取；枯草桿菌堿性磷酸酶用0.1mol/L氯化鎂溶液提取等。有少數(shù)酶，如霉菌脂肪酶，用清水提取的效果較好。核酸類酶（R-酶）的提取，一般是在細(xì)胞破碎后，用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，再進(jìn)一步與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離，而得到酶RNA。2.酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。例如，胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取。3.堿溶液提取有些在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶，應(yīng)采用堿溶液提取。例如，細(xì)菌L-天冬酰胺酶可用pH11~12的堿溶液堿性提取。4.有機(jī)溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的P-酶，可以采用與水可混溶的丁醇等有機(jī)溶劑提取。例如，琥珀酸脫氫酶、膽堿酯酶等的提取。在R-酶的提取中，經(jīng)常采用苯酚水溶液。一般是在細(xì)胞破碎、制成勻漿后，加入等體積的90%苯酚水溶液，振蕩一段時(shí)間，結(jié)果DNA和蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層，而RNA溶解于水中。酶提取過程的注意事項(xiàng)在酶提取過程中，為了防止酶變性失活，溫度不宜高，尤其是采用有機(jī)溶劑提取時(shí)，溫度應(yīng)該控制在0~10℃。有些酶對溫度的耐受性較高，可在室溫或更高一些的溫度條件下提取。為了提高酶的溶解度，提取時(shí)pH酶的分離純化分離純化提取活性的酶或蛋白質(zhì)必須保持天然活性狀態(tài)；分離純化的一般步驟：材料的選擇→原料的預(yù)處理→蛋白質(zhì)的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)→純化→蛋白質(zhì)的結(jié)晶；分離純化的方法主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小、溶解度、帶電荷不同等性質(zhì)。根據(jù)分子大小不同的分離方法1.離心離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心機(jī)多種多樣，按照離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速的不同可以分為常速（低速）、高速和超速等3種。–常速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1×104g–高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為1×104~2.5×104r/min，相對離心力達(dá)到1×104g~1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5×104~8×104r/min，相對離心力可以高達(dá)5–超速離心可以采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。超速離心可用于酶分子的分離純化。在離心過程中，應(yīng)該根據(jù)需要，選擇好離心力（或離心速度）和離心時(shí)間，并且控制好溫度和pH值等條件。離心方法可分為差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心等。–差速離心是采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。差速離心主要用于分離那些大小和密度差異較大的顆粒，操作簡單、方便，但分離效果較差。–密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶離心方法。–當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時(shí)，在離心力作用下，不同浮力密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏巷h浮，一直移動到與它們各自浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶，即為等密度梯度離心。過濾與膜分離（1）過濾過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和各種高分子膜等，其中以各種高分子膜為過濾介質(zhì)的過濾技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。微濾、超濾、