微血栓致缺血性心肌病發(fā)病機制的研究

微血栓致缺血性心肌病發(fā)病機制的研究微血栓致缺血性心肌病發(fā)病機制的研究，現在的生活越來越好了，發(fā)病率卻比起以前來又更多了點，今天一起來認識下缺血性心肌病的研究。提高下科普的水平，還是有好處的1材料和方法：1.1動物雄性SD大鼠90只體重(250±30)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)學院動物中心。實驗動物及實驗步均按照合國家實驗動物管理條列執(zhí)行。1.2試劑與器材月桂酸鈉(Sigma，L9755)，大鼠可溶性血栓調節(jié)蛋白(solublethrombomdulin，sTM)ELISA試劑盒(美國R&D)，中性甲醛固定液(南京化學試劑公司生產)，戊二醛(湖北新景新材料有限公司)MotecDigitalMicroscope成像分析系統(tǒng)(德國Motec)，透射電子顯微鏡(日本JEOL)，超聲儀(GEVivid7)，L550離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。1.3實驗分組90只大鼠隨機分成3組：模型組30只，假手術組30只和正常對照組30只，各組中隨機選擇12只進行超聲檢測，另于術后1、7、28天每組各選6只進行組織學檢查。1.4實驗方法SD大鼠，10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔內注射麻醉，常規(guī)備皮，氣管插管連接呼吸機，右側臥位固定，于左前外側第三肋間開胸，逐層剝離進入胸腔，分離主動脈并用血管夾夾閉主動脈后，迅速以微量注射器從主動脈根部注射月桂酸鈉(1μg/g)，夾閉20s，松開血管夾，待呼吸心跳穩(wěn)定后逐層關胸，拔除氣管插管，術畢腹腔注射80萬單位青霉素并于術后連續(xù)抗炎3日，普通飼養(yǎng)。假手術組給予同等劑量的生理鹽水替代月桂酸鈉進行冠脈內注射，正常對照組不進行任何處理，余均同模型組。各組于術后1、7、28天，分別取6只鼠處死，取材進行指標檢測。1.5檢測指標1.5.1病理組織學檢測：按照時間點取鼠處死，開胸，取出心臟，修剪去除心耳及主要大血管，中性甲醛固定，石蠟包埋。取左室乳頭肌段心肌，連續(xù)切片，將組織切成4μm厚的切片。每只鼠隨機取兩張切片進行HE以染色觀察微血栓的形成。微血栓指在小于150μm的微血管中，由血小板、纖維素或/和紅細胞組成，HE染色呈粉紅色，單純的紅細胞堆積認為是血管中殘留的血液，HE染色呈點樣深紅色[7]。同時取兩張切片進行馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(改良Lendrum法)染色，觀察冠脈微血管原位栓塞組成成分，纖維素呈鮮紅色，肌纖維呈紅色，細胞核呈藍褐色，膠原纖維呈藍色，紅細胞呈黃色，陳舊的纖維素成紫藍色。1.5.2透射電鏡檢查于術后第7天，取大鼠左心室組織，4℃條件下制成約1mm3成組織塊，迅速置于2.5%戊二醛固定液中固定24小時，經脫水、浸透、包埋后制成切片，進行染色，在透射電鏡下觀察微血管超微結構的改變。1.5.3血漿sTM檢測各組動物均于細胞移植后1、7、28天取血2ml(n=6/組/時間點)，3000rpm離心10min，收集上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中sTM的濃度。1.5.4心功能檢測將大鼠麻醉后，備皮，仰臥位固定于檢查臺上，用10MHz超聲探頭進行超聲檢查，每只大鼠記錄3個心動周期以計算左室收縮末期容積(LVIDs)、左室舒張末期容積(LVIDd)內徑的平均值、左室射血分數(EF%)和短軸縮短率(FS%)。每個指標檢測3次，計算均值為最終的數值。1.6統(tǒng)計學處理用SPSS15.0軟件分析，計量資料以x±s表示，組間均數的比較采用單因數方差分析，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Games-Howell檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2實驗結果2.1微血管原位血栓形成模型組HE染色顯示，心肌微血管內彌漫分布著由血細胞、血小板和纖維蛋白構成的半透明粉紅色血栓混合物，并可見局部心肌凋亡壞死(圖-1)。馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(改良Lendrum法)染色則表明，血管內微栓塞的成分多由紅色的纖維素和藍色的膠原所組成(圖-2)。而在假手術組和對照組則未見同樣的特征性改變。2.2透射電鏡觀察結果模型組微血管內皮細胞細胞核過度收縮，核膜有下大面積染色質凝聚，形成高密度斑塊，飲泡數量明顯減少，線粒體絮狀改變，內質網減少，內皮細胞間緊密連接呈增寬斷裂狀，血管腔攣縮狹窄，腔內可見膠原成分。假手術組可見微血管內皮細胞核呈梭形結構良好，質膜下存在大量飲泡，核內細胞器豐富，核一端相鄰細胞緊密連接清晰可見，管腔大完整，內有大量紅細胞2.3血漿sTM含量測定與對照組相比，術后模型組在各時間點大鼠血清sTM含量明顯增加(P<0.05)，1天時既有明顯升高，7天時最高，至28天時下降至術后一天水平(表-1)。假手術組術組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學差異。2.4心功能檢測與對照組比較，模型組在術后1天心功能即開始下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);7天時各項心功能指標，模型組與對照組相比存在明顯降低(P<0.05);28天時，可見差異繼續(xù)增大(P<0.05)。而在同時間點假手組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義3討論研究結果表明，冠狀動脈微循環(huán)在心肌整體血供體系中扮演了極其重要的角色，引起冠脈微循環(huán)障礙的原因主要可分為原位血栓形成和微栓子栓塞[8]：斑塊中的脂質碎片、基質成分及內皮細胞、炎癥細胞脫落、血小板及白細胞黏附聚集均可造成微小血管栓塞，冠脈血管介入(PCI)治療均可能導致微血管栓塞,使心肌灌注發(fā)生障礙,引起心肌缺血，在即刻或遠期預后方面具有重要意義。但并非僅有自發(fā)性的斑塊破裂才導致微血管栓塞,臨床觀察發(fā)現,在血管介入治療中,幾乎所有的患者均有致血栓物質的釋出[9,10],并可能形成微血管原位血栓的形成,同樣會導致心肌灌注發(fā)生障礙。因此,防止及減少微栓塞發(fā)生和微血栓的形成具有重要的臨床意義。目前研究認為在血栓的過程中，血管內皮細胞功能和結構的完整具有重要的作用[11]，在原位血栓的形成過程中可能也與內皮功能障礙有關。因而采用向冠脈注射月桂酸鈉的方法來誘發(fā)微血栓的形成[12]。月桂酸鈉以往常被用于制造外周動脈的血栓栓塞模型[13,14]，來評價研究抗血小板及抗血栓類藥物的療效及機理。由于月桂酸鈉有強烈的內皮損傷作用,可造成血管內皮的脫落，甚至穿孔;注射1mL(1gPL)月桂酸鈉可以造成下肢動脈內皮損傷、血栓形成，并進一步發(fā)生壞疽[15]。在試驗中我們發(fā)現在桂酸鈉的作用下，冠脈微血管內皮細胞的超微結構發(fā)生了明顯的變化，細胞核固縮，染色質聚集，細胞器減少，細胞間緊密連接斷裂增寬，血管腔攣縮狹窄。病理染色則顯示在微血管處存在大量由膠原和纖維素構成的血栓形成。以上結果表明，月桂酸鈉損傷內皮細胞，致使血管的完整性受損，內皮下基質暴露，誘發(fā)凝血，最終導致原位微血栓的形成?？扇苄匝ㄕ{節(jié)蛋白(TM)是由由血管內皮細胞分泌產生，是蛋白C系統(tǒng)的重要組成成分，其與血酶結合形成T-TM復合物而激活蛋白C系統(tǒng)，血管內皮細胞蛋白C受體能加強T-TM活化蛋白C，從而提示TM參與激活蛋白C系統(tǒng)的過程。而另一方面TM通過與活化的蛋白C的結合還可以抑制活化蛋白C的活性，因而TM在凝血和抗凝過程中具有重要作用，以往對TM的研究主要集中在凝血和纖溶作用中，而近年來的研究表明TM可作為某些疾病血管內皮損傷的分子標志以檢測血管內皮的損傷情況[16,17]。在本實驗中可見在術后1天時模型組TM含量既有明顯升高，7天時最高，至28天時下降至術后一天水平。這可能與血栓局部炎癥反應有一定聯(lián)系?？傊ㄟ^向冠狀動脈內注射月桂酸鈉的方法，可以成功構建大鼠冠脈微血栓的動物模型，其機制與月