慢病毒包裝實驗

第第頁慢病毒包裝試驗慢病毒包裝試驗慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV1（人類免疫缺陷1型病毒）為基礎進展起來的基因治療載體。慢病毒具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細胞、長期穩(wěn)定表達外源基因等優(yōu)點，因此成為導入外源基因的有力工具?，F(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應用到各種細胞系的基因過表達、RNA干擾、microRNA討論以及活體動物試驗中。一、試驗流程圖1、慢病毒包裝試驗流程圖二、試驗儀器與試驗材料psPAX2質(zhì)粒，pMD2.G質(zhì)粒，pHBLVTM系列質(zhì)粒；293T細胞；wan全培育基；DH5α菌株；Stbl3菌株。三、試驗步驟1.質(zhì)粒擴增。將構(gòu)建好的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒使用大抽試劑盒進行質(zhì)粒的去內(nèi)毒素抽提，濃度建議不低于1μg/μl，A260/280在1.71.8間方可用于病毒包裝。推舉使用Qiagen大抽試劑盒進行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提（質(zhì)粒質(zhì)量會極大影響后續(xù)轉(zhuǎn)染效率和病毒的滴度）。2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，在10cm皿中接種生長狀態(tài)良好的293T細胞，以第二天匯合度能達到30%～50%為宜。24h后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前需要把DMEM和慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑LentiFitTM恢復至室溫，使用前需搖勻。每個皿的質(zhì)粒成分如下：表1、慢病毒包裝轉(zhuǎn)染體系用于包裝的三個質(zhì)粒摩爾比通常為1:1:1，可以依據(jù)情況稍加調(diào)整。請參考LentiFitTM轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后46h換新鮮培育基。3.病毒收集和離心。轉(zhuǎn)染后48h和72h分別兩次收集病毒上清（48h收集后置換新鮮培液），將收集的上清用0.45μm濾器過濾，然后放于超速離心管中，4℃，72000g離心120min。4.病毒重懸和保存。棄上清，500μl重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于4℃保存，如需長時間存放需置于80℃或液氮罐保存。（注：實在重懸體積依據(jù)試驗需求而定）5.滴度測定。在96孔板中鋪合適數(shù)量的293T細胞，第二天將慢病毒原液進行梯度稀釋后分別感染293T細胞，感染24h后換成無病毒的培育液，感染72h后在熒光顯微鏡下察看結(jié)果，對熒光比例合適（10～30%之間）的孔進行細胞計數(shù)。滴度計算公式為：滴度（TU/ml）=細胞數(shù)×熒光百分比×103/病毒原液體積四、注意事項1.慢病毒相關試驗請在生物安全柜（BL2級別）內(nèi)操作。2.操作病毒時請穿試驗服，佩戴口罩和手套，盡量不要暴露雙手及手臂的皮膚。3.操作病毒時特別當心病毒濺出。假如操作時超凈工作臺有bing毒污染，請立刻用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培育板、培育液請于84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。4.如需要離心，應使用密封性好的離心管，如有必要請用封口膜封口后離心。5.病毒相關的廢棄物需要特別收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。6.試驗完畢用香皂清洗雙手。五、常見問題1.影響慢病毒出毒及滴度的原因有哪些？（1）質(zhì)粒。包毒前需要對包裝及表達質(zhì)粒進行去內(nèi)毒素處理，濃度建議不低于1μg/μl，A260/280在1.71.8間；（2）轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒比例。要用轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性小的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒間比例得當，建議三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時的摩爾比為1:1:1可依據(jù)目的基因大小進行調(diào)整；（3）目的基因。一般慢病毒包裝的目的片段大小在3k以內(nèi)較為合適，大于3k會降低滴度或超過載體容量無法包裝、目的基因本身是否具有毒性也會影響慢病毒的出毒效率；（4）包裝細胞293T細胞的狀態(tài)。細胞出毒過程中的細胞活力是包裝成功及病毒滴度高處與低處的一個緊要環(huán)節(jié)，進行包裝轉(zhuǎn)染293T細胞前肯定要重視細胞是否干凈、飽滿立體感是否好、鋪板是否均勻，細胞密度在5060%時進行包裝比較合適；（5）病毒收集：在24、48h察看細胞及熒光狀態(tài)，判定是否正常，轉(zhuǎn)染后48h和72h分別兩次收集病毒上清（48h收集后置換新鮮培液）。2.該如何選擇合適的慢病毒包裝質(zhì)粒？慢病毒常用的包裝系統(tǒng)是二代三質(zhì)粒系統(tǒng)，骨架質(zhì)粒pSPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G是明確的包裝質(zhì)粒。目的基因的表達質(zhì)粒需要依據(jù)試驗需求進行選擇，重要包括啟動子、標簽蛋白、熒光和抗性等元件。（1）目的基因的過表達通常選擇CMV/EF1a啟動子，目的基因的干擾通常選擇U6啟動子；（2）若需要穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，則需攜帶PURO/BSD/NEO等抗性篩選基因；（3）后續(xù)需要察看慢病毒感染效率一般需要攜帶EGFP/mCherry等熒光蛋白