DB32T3762.14-2021新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序

ICS11.020

C62DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3762.14—2021

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范

第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part14:Real-timefluorescencePCRtestNsubgenomicRNAprocedure

2021-12-09發(fā)布2022-01-09實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.14—2021

前??言

DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范》目前分為以下部分：

——第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；

——第2部分：病毒分離與鑒定；

——第3部分：核酸熒光PCR檢測程序；

——第4部分：重組酶介導(dǎo)等溫擴(kuò)增程序；

——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測程序；

——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；

——第7部分：空氣樣本檢測與評估；

——第8部分：物體表面檢測與評估；

——第9部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測與評估。

——第10部分：微量血清中和試驗；

——第11部分：全基因組高通量測序；

——第12部分：藥物體外抗病毒效果測定；

——第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序；

——第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序；

——第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測程序；

——第16部分：核酸數(shù)字PCR法；

——第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質(zhì)控品；

——第18部分：規(guī)模化核酸檢測程序。

本文件為DB32/T3762的第14部分。

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出。

本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。

本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、無錫市疾病預(yù)防控制中心、鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心、

常州市疾病預(yù)防控制中心。

本文件主要起草人：朱小娟、崔侖標(biāo)、朱寶立、葛以躍、吳濤、吳斌、趙康辰、喬喬、陳銀、肖勇、

徐虹、王鳳鳴。

II

DB32/T3762.14—2021

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒N亞基因組熒光PCR檢測環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、樣

本前處理與核酸提取、擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增、結(jié)果判定。

本文件適用于新型冠狀病毒N亞基因組熒光PCR檢測，為判斷樣本中的新型冠狀病毒是否具有感

染性提供輔助手段。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本

文件。

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序

3術(shù)語和定義

3.1

亞基因組RNAsubgenomicRNA，SgRNA

在結(jié)構(gòu)上由病毒5’UTR區(qū)Leader序列及各基因轉(zhuǎn)錄RNA片段構(gòu)成，亞基因組的出現(xiàn)可反應(yīng)病毒復(fù)制

狀態(tài)，從而代表病毒的感染性。

4環(huán)境與設(shè)施

同DB32/T3762.3的4.1條和4.2條。

5設(shè)備與耗材

同DB32/T3762.3的5.1條和5.2條。

6試劑與材料

6.1試劑

6.1.1病毒核酸提取試劑盒。

6.1.2實時熒光PCR檢測試劑。

6.2引物與探針

1

DB32/T3762.14—2021

新型冠狀病毒N亞基因組的熒光定量PCR引物、探針組合物（序列見附錄A），其中探針的5’端

標(biāo)記的是FAM熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記的是BHQ1熒光淬滅基團(tuán)。陰性對照為DEPC水、陽性對照為含N

亞基因組片段的質(zhì)粒（序列見附錄A）。

6.3材料

同DB32/T3762.3的6.2條。

7樣本前處理與核酸提取

同DB32/T3762.3-2020的7.1條和7.2條。

8擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增

8.1采用實時熒光PCR檢測試劑，根據(jù)試劑說明書配制熒光PCR擴(kuò)增體系，N亞基因組反應(yīng)體系中

上/下游引物（20μmol/L）0.4μL/0.4μL，探針（10μmol/L）0.4μL每個反應(yīng)體系中加入模板RNA4μL

(或陽性、陰性對照)、無RNAase滅菌水加至20μL。

8.2按以下參數(shù)進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增（具體擴(kuò)增條件可根據(jù)實時熒光PCR檢測試劑進(jìn)行調(diào)整），42℃

5min，95℃10sec，45個循環(huán)的95℃5sec，55℃34sec，在每個55℃反應(yīng)結(jié)束時收集熒光信號。

9結(jié)果判定

9.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)。

9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

9.2.1一般要求

檢測結(jié)果中的陰、陽性對照均符合以下情況，如對照不成立，此次試驗視為無效。

9.2.2陰性對照

陰性對照無擴(kuò)增曲線，或Ct值大于40。

9.2.3陽性對照

陽性對照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值小于或等于35。

9.3結(jié)果判斷

9.3.1陽性判定：檢測樣本N亞基因組的Ct值小于或等于40，并有明顯擴(kuò)增曲線，則判定為亞基因

陽性。

9.3.2陰性判定：在對照成立下，如果檢測樣本N亞基因組沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，或Ct值大于40，則

判定為亞基因陰性。

9.3.3不確定結(jié)果：在對照成立下，如果檢測樣本N亞基因組擴(kuò)增曲線不典型，結(jié)果不確定，建議重

復(fù)檢測。

2

DB32/T3762.14—2021

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

新型冠狀病毒N亞基因組實時熒光PCR引物與探針序列及陽性對照片段序列

A.1表A.1中給出了新型冠狀病毒N亞基因組實時熒光PCR檢測的引物與探針及陽性對照片段序列。

表A.1新型冠狀病毒N亞基因組實時熒光PCR引物與探針序列及陽性對照片段序列

引物名稱引物序列(5'to3')長度（bp）

nCov-SgRNAN-FACCAACTTTCGATCTCTTGTAGA23

nCov-SgRNAN-RTGAGGGTCCACCAAACGTA19

nCov-SgRNAN-ProbeCAGCGAAATGCACCCCGCA19

ACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTT

陽性對照新型冠狀病毒N亞CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTATGTCTGATA

115

基因片段ATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCC

GCATTACGTTTGGTGGACCCTCA

_________________________________

3

DB32/T3762.14—2021

目??次

前??言..............................................................................................................................................................II

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.....................................................................................................................................................1

4環(huán)境與設(shè)施.....................................................................................................................................................1

5設(shè)備與耗材.....................................................................................................................................................1

6試劑與材料.....................................................................................................................................................1

7樣本前處理與核酸提取.................................................................................................................................2

8擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增.....................................................................................................................................2

9結(jié)果判定.........................................................................................................................................................2

10附錄A..............................................................................................................................................................3

I

DB32/T3762.14—2021

新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒N亞基因組熒光PCR檢測環(huán)境與設(shè)施、設(shè)備與耗材、試劑與材料、樣

本前處理與核酸提取、擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增、結(jié)果判定。

本文件適用于新型冠狀病毒N亞基因組熒光PCR檢測，為判斷樣本中的新型冠狀病毒是否具有感

染性提供輔助手段。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本

文件。

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序

3術(shù)語和定義

3.1

亞基因組RNAsubgenomicRNA，SgRNA

在結(jié)構(gòu)上由病毒5’UTR區(qū)Leader序列及各基因轉(zhuǎn)錄RNA片段構(gòu)成，亞基因組的出現(xiàn)可反應(yīng)病毒復(fù)制

狀態(tài)，從而代表病毒的感染性。

4環(huán)境與設(shè)施

同DB32/T3762.3的4.1條和4.2條。

5設(shè)備與耗材

同DB32/T3762.3的5.1條和5.2條。

6試劑與材料

6.1試劑

6.1.1病毒核酸提取試劑盒。

6.1.2實時熒光PCR檢測試劑。

6.2引物與探針

1

DB32/T3762.14—2021

新型冠狀病毒N亞基因組的熒光定量PCR引物、探針組合物（序列見附錄A），其中探針的5’端

標(biāo)記的是FAM熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記的是BHQ1熒光淬滅基團(tuán)。陰性對照為DEPC水、陽性對照為含N

亞基因組片段的質(zhì)粒（序列見附錄A）。

6.3材料

同DB32/T3762.3的6.2條。

7樣本前處理與核酸提取

同DB32/T3762.3-2020的7.1條和7.2條。

8擴(kuò)增體系配制與擴(kuò)增

8.1采用實時熒光PCR檢測試劑，根據(jù)試劑說明書配制熒光P