酶分子的修飾

酶分子的修飾1、什么是酶分子修飾2、酶分子的修飾方法3、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGo4、酶分子修飾應(yīng)用Go第2頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(物質(zhì))，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。一、什么是酶分子修飾第3頁,共39頁，2024年2月25日，星期天天然酶的缺陷細(xì)胞外穩(wěn)定性差:易于變性失活（酸、堿、有機溶劑、熱）；容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制酶活性不夠高工業(yè)反應(yīng)要求的酸度和溫度并不總是在酶反應(yīng)的最適酸度和溫度范圍內(nèi)具有抗原性酶做為藥物在體內(nèi)的半衰期較短等因素限制了酶制劑的應(yīng)用

第4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天提高酶的活力增強酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）降低或消除酶的抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）產(chǎn)生新的催化能力研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響)酶分子修飾的目的第5頁,共39頁，2024年2月25日，星期天1金屬離子置換修飾2大分子結(jié)合修飾(共價/非共價)3側(cè)鏈基團修飾4肽鏈有限水解修飾5氨基酸置換修飾6酶分子的物理修飾

二、酶分子的修飾方法第6頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。

α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+），超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+，Zn2+)1、酶的金屬離子置換修飾第7頁,共39頁，2024年2月25日，星期天①酶的分離純化首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。②除去原有的金屬離子在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。⑴金屬離子置換修飾的過程③加入置換離子于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。第8頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。第9頁,共39頁，2024年2月25日，星期天①闡明金屬離子對酶催化作用的影響②提高酶的催化效率③增強酶的穩(wěn)定性(如SOD)④改變酶的動力學(xué)特性⑵金屬離子置換修飾的作用第10頁,共39頁，2024年2月25日，星期天目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。水溶性大分子通過共價鍵與酶的側(cè)鏈基團共價結(jié)合，使酶分子空間構(gòu)想發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、肝素、蔗糖聚合物等。如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）、PEG－溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）、PEG－天門冬酰胺酶。根據(jù)修飾分子的大小和對酶分子的作用方式，可分為非共價修飾和共價修飾兩類2、酶的大分子修飾第11頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。

一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。⑴非共價修飾第12頁,共39頁，2024年2月25日，星期天⑵共價修飾

用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。

第13頁,共39頁，2024年2月25日，星期天修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團進(jìn)行反應(yīng)。⑶大分子修飾(共價)的過程第14頁,共39頁，2024年2月25日，星期天修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。

分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。第15頁,共39頁，2024年2月25日，星期天②增強酶的穩(wěn)定性③降低或消除酶蛋白的抗原性①提高酶的催化效率每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍

例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。⑷大分子修飾的作用第16頁,共39頁，2024年2月25日，星期天酶

半衰期相對穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。第17頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。如研究酶的活性中心中的必需基團。3、酶分子的側(cè)鏈基團修飾第18頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

酶蛋白的側(cè)鏈基團是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。⑴能進(jìn)行化學(xué)修飾的氨基酸側(cè)鏈基團第19頁,共39頁，2024年2月25日，星期天非極性R基氨基酸（共8種）：丙氨酸（Ala，A）亮氨酸（Leu，L）纈氨酸（Val，V）異亮氨酸（Ile，I）苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)）色氨酸（Trp，W）甲硫氨酸（Met，M）脯氨酸（Pro，P）無電荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸（Ser，S）蘇氨酸（Thr，T）酪氨酸（Tyr，Y）半胱氨酸（Cys，C）天冬酰胺（Asn，N）甘氨酸（Gly，G）谷氨酰胺（Gln，Q）帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸（Lys，K）精氨酸（Arg，R）組氨酸（His，H）20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸（Asp，D）谷氨酸（Glu，E）第20頁,共39頁，2024年2月25日，星期天側(cè)鏈基團：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團。包括氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基和吲哚基。第21頁,共39頁，2024年2月25日，星期天⑵化學(xué)修飾反應(yīng)的類型主要反應(yīng)：烷基化反應(yīng)、酰化反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)第22頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。4、酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）第23頁,共39頁，2024年2月25日，星期天⑴胃蛋白酶原的激活

第24頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共39頁，2024年2月25日，星期天⑵

胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

第26頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。通過兩個途徑實現(xiàn)：化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。蛋白質(zhì)工程：利用基因操縱技術(shù)。5、氨基酸置換修飾第27頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性?；瘜W(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。⑴化學(xué)修飾法第28頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術(shù)。定點突變是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。定點突變技術(shù)為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。⑵定點突變第29頁,共39頁，2024年2月25日，星期天⑶酶分子的定點突變技術(shù)①基因序列分析②蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析③酶活性中心分析④引物設(shè)計進(jìn)行基因定點突變⑤酶基因克隆表達(dá)⑥變異特性分析第30頁,共39頁，2024年2月25日，星期天6、酶分子的物理修飾

通過各種物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的方法。高壓修飾的纖維素酶比天然酶的活力提高10%。通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。第31頁,共39頁，2024年2月25日，星期天四酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。第32頁,共39頁，2024年2月25日，星期天半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第33頁,共39頁，2024年2月25日，星期天五酶化學(xué)修飾的應(yīng)用⑴

在酶