課題血紅蛋白的提取和分離

課題血紅蛋白的提取和分離第2頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、分離生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子2、蛋白質(zhì)分離和提取的原理根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同蛋白質(zhì)相關(guān)鏈接第3頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種特性，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性，空間結(jié)構(gòu)4、人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富（紅色）便于提取血紅蛋白第4頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天一.基礎(chǔ)知識(shí)

（一）

凝膠色譜法：（也叫分配色譜法）根據(jù)被分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用來(lái)分離蛋白質(zhì)的有效方法.1、概念：2、凝膠色譜法的原理—分子篩效應(yīng)①大多數(shù)凝膠是由多糖類(lèi)化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。②當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較。③分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。3、依據(jù)的特性：相對(duì)分子質(zhì)量的大小4、具體過(guò)程第5頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，

促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)?；旌衔锷现疵摯蠓肿恿鲃?dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子

第6頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變1、作用2、緩沖溶液的配制通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液閱讀：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)第7頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）電泳：1、概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程2、原理:①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離3、常見(jiàn)方法:瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳4、實(shí)例①應(yīng)用十二烷基磺酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量第8頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素②原理③

SDS作用為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入SDS,SDS能與各種蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小第9頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)操作樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定1、樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟:(四步）血液組成（二）操作過(guò)程①成分血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無(wú)機(jī)鹽磷脂葡萄糖血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)a－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)第10頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色②組成及作用本課題可選用豬、牛、羊或其他哺乳動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白③選材(1)紅細(xì)胞的洗滌①洗滌紅細(xì)胞目的除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過(guò)少②洗滌操作A、采集血樣B、低速短時(shí)間離心（為什么）速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果第11頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天C、吸取血漿：上層透明的黃色血漿D、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌E、低速離心（低速短時(shí)間）F、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈(2)血紅蛋白的釋放加蒸餾水（使紅細(xì)胞大量吸水脹裂）到原血液體積，再加40％體積的甲苯（溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜），置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白(3)分離血紅蛋白溶液①過(guò)程將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min第12頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）②試管中溶液層次第13頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體③分離第14頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)2、粗分離除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品中的緩沖液①過(guò)程②透析目的（透析）第15頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、隨著人類(lèi)跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是（）A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程D獲得高純度的蛋白質(zhì)D2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是()A相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無(wú)法比較A

教學(xué)反饋第17頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。

A分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小

C帶電荷的多少D溶解度4．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)持（）基本不變。

A溫維度BpHC滲透壓D氧氣濃度5．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。

A相同B相反C相對(duì)D相向6.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。

A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白BBBA第18頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天7．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。

A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞8．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ?/p>

A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）

A無(wú)色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層

C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物CDC第19頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天第20頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、純化（凝膠色譜操作）（1）凝膠色譜柱的制作①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端第21頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底注意事項(xiàng)：③頂塞的制作打孔安裝玻璃管④組裝將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體第22頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天第23頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇A、材料“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克B、代表意義：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）第24頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法A、固定B、裝填將色譜柱處置固定在支架上將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻第25頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意：2、裝填凝膠柱時(shí)不得氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙思考:你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？第26頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天第27頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果在裝填過(guò)程中要注意些什么問(wèn)題呢？2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)④洗滌平衡第28頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關(guān)閉出口第29頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天③樣品滲入凝膠床④洗脫加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口小心加入pH為7的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）第31頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天討論：答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能⑥注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)1、在血紅蛋白的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？第32頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。第33頁(yè),共37頁(yè)，2024年2月25日，星期天血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的