中和試驗(yàn)完整版本

病毒中和試驗(yàn)

VirusNeutralizationTest2012.7.17張文昌背景原理方法應(yīng)用各種方法利弊分析發(fā)展趨勢(shì)質(zhì)量控制（一）背景介紹1.當(dāng)病原微生物侵入機(jī)體時(shí)會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。2.病原微生物入侵細(xì)胞時(shí)需要依賴病原體自身表達(dá)的特定分子與細(xì)胞上的受體結(jié)合，才能感染細(xì)胞，并進(jìn)一步擴(kuò)增。3.病毒完整的復(fù)制周期

3d動(dòng)畫之艾滋病病毒復(fù)制.flv4.病毒的中和抗體（neutralizationantibody）指：針對(duì)病毒某些表面抗原的抗體，此類抗體能與細(xì)胞外游離的病毒結(jié)合從而消除病毒的感染能力。5.中和抗體的作用機(jī)制：

①直接封閉病毒表面抗原，如與病毒表面吸附蛋白（VAP）結(jié)合，從而阻斷病毒的吸附②改變病毒表面結(jié)構(gòu)③病毒與中和抗體形成的免疫復(fù)合物，易被巨噬細(xì)胞吞噬清除④有包膜的病毒表面抗原與中和抗體結(jié)合后，激活補(bǔ)體，可導(dǎo)致病毒的裂解圖1.中和抗體作用機(jī)制Antibodiescanneutralizeviralinfectivityinanumberofways,assummarizedintheillustration.Theymayinterferewithvirionbindingtoreceptors,blockuptakeintocells,preventuncoatingofthegenomesinendosomes,orcauseaggregationofvirusparticles.Manyenvelopedvirusesarelysedwhenantiviralantibodiesandserumcomplementdisruptmembranes.6.病毒中和試驗(yàn)：Neutralizationofavirusisdefinedasthelossofinfectivitythroughreactionoftheviruswithspecificantibody.以測(cè)定病毒感染力為基礎(chǔ)，以病毒受免疫血清中和后殘存的感染力為依據(jù)，來判定免疫血清中和病毒的能力。常用于檢測(cè)患者血清中抗體消長(zhǎng)情況，抗原免疫原性評(píng)價(jià)，也可用來鑒定未知病毒或?qū)Σ《具M(jìn)行半定量等。（二）原理特異的抗病毒免疫血清（中和抗體）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和。中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價(jià)的中和抗體。（三）方法

1.中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)

體內(nèi)中和試驗(yàn)也稱保護(hù)試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)先對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種疫苗或抗血清，間隔一定時(shí)間后，再用一定量病毒攻擊，最后根據(jù)動(dòng)物是否得到保護(hù)來判定結(jié)果。常用于疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)和抗血清的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

疫苗或抗血清一定時(shí)間適量病毒致死狀態(tài)等判斷結(jié)果

體外中和試驗(yàn)是將抗血清與病毒混合，在適當(dāng)條件下作用一定時(shí)間后，接種于敏感細(xì)胞、雞胚以檢測(cè)混合液中病毒的感染力。根據(jù)保護(hù)效果的差異，判斷該病毒是否已被中和，并可計(jì)算中和指數(shù)，即中和抗體的效價(jià)。2.根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法。一為固定病毒用量與等量一系列倍比稀釋的血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，以血清中和抗體滴度表示。二為固定血清用量與等量一系列對(duì)數(shù)稀釋的病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)。結(jié)果以中和指數(shù)表示。

固定血清稀釋病毒法：已知效價(jià)的抗血清（通常為陰性對(duì)照）測(cè)定未知效價(jià)的抗血清結(jié)果以中和指數(shù)表示試驗(yàn)組LD50(EID50、TCID50)中和指數(shù)=──────────────────對(duì)照組LD50(EID50、TCID50)

固定病毒稀釋血清法：已知效價(jià)（滴度）的病毒測(cè)定抗血清的效價(jià)結(jié)果以血清中中和抗體滴度表示(四)應(yīng)用1.蝕斑減少中和實(shí)驗(yàn)（Plaque

ReductionNeutralizationTestPRNT）蝕斑減少中和試驗(yàn)是檢測(cè)血清中和抗體的一種敏感性較高的方法，試驗(yàn)以使蝕斑數(shù)減少50％的血清稀釋度作為其中的效價(jià)。試驗(yàn)使用定量的病毒（100PFU）與不同稀釋度的等量血清混合后感作,接種預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細(xì)胞,再覆蓋上營(yíng)養(yǎng)瓊脂置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),數(shù)天后分別統(tǒng)計(jì)蝕斑數(shù),用Karber法計(jì)算該血清的蝕斑中和效價(jià)。

以HCMV中和抗體效價(jià)測(cè)定為例2倍稀釋血清樣品，終體積0.2ml200PFUHCMV每孔0.2ml加到24孔板中以長(zhǎng)成單層MRC-5細(xì)胞37℃孵育1h棄去液體，PBS洗三次含0.3%瓊脂的維持液覆蓋3-5天再次覆蓋14天甲醛固定孵育1h甲基藍(lán)染色中和抗體效價(jià)的測(cè)定

同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照，病毒對(duì)照組只加病毒不加血清，細(xì)胞對(duì)照組用維持液代替血清和病毒。

病毒對(duì)照組細(xì)胞全部病變（100%），細(xì)胞對(duì)照組不出現(xiàn)噬斑。圖2.登革熱病毒感染敏感細(xì)胞出現(xiàn)的蝕斑2.快速微量中和試驗(yàn)一種人巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)快速檢測(cè)方法的建立HCMV感染具有嚴(yán)格種屬特異性，一般體外采用HELF（人胚肺成纖維細(xì)胞）增殖該病毒，體外的感染實(shí)驗(yàn)也多在一些成纖維細(xì)胞如MRC-5上進(jìn)行。但是HCMV完整的增殖周期比較長(zhǎng)，一般一周左右才能裂解細(xì)胞釋放病毒粒子。IE1是病毒進(jìn)入細(xì)胞后最早表達(dá)（2-4h)的蛋白之一，6小時(shí)便可在細(xì)胞核中檢測(cè)到。IE基因?qū)Σ《镜腅基因以及L基因的表達(dá)乃至整個(gè)病毒的復(fù)制周期都有非常重要的作用。

實(shí)驗(yàn)流程血清滅活用維持液2倍稀釋血清每孔終體積25μl與等體積已知滴度的病毒混合，37℃中和不同時(shí)間56℃30分鐘，不同來源的血清滅火溫度和時(shí)間可能不同45min60min75min90min步驟一步驟二動(dòng)物血清中，含有多種蛋白質(zhì)成分對(duì)抗體中和病毒有輔助作用，如補(bǔ)體、免疫球蛋白和抗補(bǔ)體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應(yīng)因素，用于中和試驗(yàn)的血清須經(jīng)加熱滅活處理。加至已長(zhǎng)成單層的MRC-5細(xì)胞步驟三所鋪細(xì)胞數(shù)目要求較高，防止細(xì)胞疊層16h，18h，20h梯度乙醇固定細(xì)胞，封閉30min相繼用IE1單抗，生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG，鏈霉親和素-HRP，以及底物顯色圖像采集與數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)組病毒對(duì)照細(xì)胞對(duì)照步驟一25μl血清25μl維持液25μl維持液步驟二25μl病毒25μl病毒25μl維持液步驟三50μl混合液50μl混合液50μl混合液圖3.感染HCMV的MRC-5細(xì)胞的體視顯微鏡（B，×25）圖像本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面

HCMV感染普遍存在，不管是患者血清學(xué)檢查或是開發(fā)HCMV特異中和抗體產(chǎn)品（如雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)中和抗體的檢測(cè)或是成品的質(zhì)控），快速準(zhǔn)確的測(cè)定樣品中中和抗體效價(jià)都是關(guān)鍵。以往運(yùn)用普通的中和試驗(yàn)，觀察典型CPE出現(xiàn)，需要6-7天才能得出結(jié)果，離實(shí)際需要相差很遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用96孔板里做酶聯(lián)免疫檢測(cè)病毒IE1基因的表達(dá)，來確定病毒是否被中和抗體所中和，檢測(cè)結(jié)果可在兩天內(nèi)讀出?？笻CMVIE單抗的出現(xiàn)促進(jìn)酶聯(lián)免疫法在HCMV中和抗體效價(jià)檢測(cè)中的應(yīng)用，一些新型快速微量中和試驗(yàn)相繼建立，但結(jié)果需通過人工計(jì)數(shù)，檢測(cè)通量不高，本實(shí)驗(yàn)使用CCD進(jìn)行圖像采集和克隆計(jì)數(shù)軟件分析和計(jì)算，結(jié)果準(zhǔn)確客觀本實(shí)驗(yàn)參照酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT），并使用生物素-親和素系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大，靈敏度有所提高。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，樣品用量?jī)H為25μl，節(jié)約成本。無需昂貴的熒光顯微鏡，不受熒光信號(hào)容易淬滅影響。（五）各種方法利弊分析體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)軌蚋诱鎸?shí)的反映病毒和抗血清在體內(nèi)的作用狀態(tài)。然而試驗(yàn)成本較高，而且實(shí)驗(yàn)受動(dòng)物個(gè)體間免疫力差異影響較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性也不如體外實(shí)驗(yàn)。中和試驗(yàn)滴定終點(diǎn)的判斷通常以半數(shù)致死劑量LD50（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）或是半數(shù)致細(xì)胞病變劑量CCID50為指標(biāo)。然而很多病毒感染敏感細(xì)胞并不出現(xiàn)典型的CPE或是CPE出現(xiàn)比較晚，無法滿足臨床上需快速及時(shí)監(jiān)測(cè)患者血清學(xué)狀態(tài)的要求。通常滴定終點(diǎn)的判斷還需要有經(jīng)驗(yàn)，不同操作者之間主觀因素影響較大。CPE只能在細(xì)胞水平反映病毒的感染狀態(tài)，對(duì)于病毒是否進(jìn)入細(xì)胞（中和抗體主要作用是在病毒吸附和侵入階段阻斷病毒感染），感染進(jìn)程無法體現(xiàn)。（六）發(fā)展趨勢(shì)中和試驗(yàn)自出現(xiàn)以來，一直在朝著快速，準(zhǔn)確，微量，重復(fù)性好等目標(biāo)發(fā)展。先后出現(xiàn)了，噬斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）,快速微量中和試驗(yàn)等。隨著各種病毒感染細(xì)胞周期事件的闡明，各種針對(duì)病毒蛋白的單克隆抗體研制工藝的成熟。利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)病毒是否進(jìn)入細(xì)胞，比以往的出現(xiàn)CPE才認(rèn)為是病毒進(jìn)入細(xì)胞更準(zhǔn)確，更快速。而且能從分子水平反映細(xì)胞的實(shí)際感染狀態(tài)。（七）質(zhì)量控制因目前尚無CMV中和抗體的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，該方法的準(zhǔn)確性無法驗(yàn)證，下面分別對(duì)精密性，耐用性和專屬性進(jìn)行驗(yàn)證。① 精密性驗(yàn)證重復(fù)性驗(yàn)證對(duì)同一份CMV-IVIG樣品在同一次試驗(yàn)中平行檢測(cè)12次，計(jì)算變異系數(shù)（CV）CV=σ/μσ為方差，μ為平均值中間精密性驗(yàn)證A：不同操作者對(duì)同一份樣品分別檢測(cè)三次B：同一操作者不同工作日對(duì)同一份樣品檢測(cè)三次分別計(jì)算CV② 穩(wěn)定性驗(yàn)證同一份CMV-IVIG樣品系列稀釋后與等體積病毒液于37℃分別孵育55,60，65min檢測(cè)HCMV中和抗體效價(jià)③ 特異性驗(yàn)證水痘帶狀皰疹病毒(vzv)感染MRC-5細(xì)胞，37℃培養(yǎng)18h，固定后進(jìn)行免疫染色觀察感染細(xì)胞核內(nèi)是否出現(xiàn)特異性著色顆粒。另取4份血漿樣品，2份普通IVIG樣品，4份CMV-IVIG樣品分別與MRC-5細(xì)胞37℃共同孵育18h，固定后進(jìn)行免疫染色，觀察核內(nèi)是否出現(xiàn)特異性著色顆粒，陰性對(duì)照加等量培養(yǎng)基，陽性對(duì)照加等量病毒液。補(bǔ)充病毒感染細(xì)胞的判斷

判斷細(xì)胞被病毒感染的方法最直接的就是CPE（cytopathiceffect），此外還有細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的免疫印跡；非特異的化學(xué)方法如病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞死亡MTT法。參考文獻(xiàn)[1]ArapidmicroneutralizationassayforcytomegalovirusJournalofVirologicalMethods,14(1986)37-41[2]ArapidmicroneutralizationassayforthemeasurementofneutralizingantibodyreactivewithhumancytomegalovirusJournalofVirologicalMethods,23(1989)157-168[3]EffectofPreviousorSimultaneousImmunizationwithCanarypoxExpressingCytomegalovirus(CMV)GlycoproteinB(gB)onResponsetoSubunitgBVaccine