均相免疫分析技術(shù)Bindingssay

均相免疫分析技術(shù)-BindingAssay5/8/20241均相免疫分析技術(shù)Bindingssay目錄TR-FRET：時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移Time-resolvedFluorescenceResonanceEnergyTransferAlpha：放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測(cè)AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay5/8/20242均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRETTime-resolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移。該技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescenceResonanceEnergyTransfer）和時(shí)間分辨（TR，TimeResolved）兩種技術(shù)。5/8/20243均相免疫分析技術(shù)BindingssayFRET：熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET技術(shù)利用了兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團(tuán)分別稱為能量供體(Donor，有銪或鋱兩種)和能量受體(Acceptor，有XL665或d2兩種)，

Donor的發(fā)射光譜與Acceptor的激發(fā)光譜重疊。Donor被外來(lái)能源激發(fā)后，其發(fā)射波譜在620nm處有一波峰，如果它與Acceptor在足夠近的距離之內(nèi)(10nm內(nèi))，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到Acceptor上。Acceptor受到激發(fā)，發(fā)出特定波長(zhǎng)（665nm）的發(fā)射光。Donor發(fā)射光譜XL665激發(fā)和發(fā)射光譜虛線為激發(fā)光譜發(fā)射光譜為陰影部分5/8/20244均相免疫分析技術(shù)BindingssayFRET：熒光共振能量轉(zhuǎn)移將Donor和Acceptor分別偶聯(lián)在相互作用的兩個(gè)生物分子上，生物分子的結(jié)合可以將Donor和Acceptor拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。由于Acceptor分子的發(fā)射光來(lái)自于能量轉(zhuǎn)移，所以在實(shí)驗(yàn)中無(wú)需將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，可實(shí)現(xiàn)均相檢測(cè)。發(fā)生FRET需要兩個(gè)條件：1、Donor的發(fā)射光譜與Acceptor的激發(fā)光譜重疊。2、

Donor與Acceptor之間距離必須在10nm內(nèi)。5/8/20245均相免疫分析技術(shù)BindingssayFRETDonorDonorAcceptor5/8/20246均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR：時(shí)間分辨TR技術(shù)是利用稀土元素中鑭系元素銪(Eu)或鋱(Tb)的獨(dú)特性質(zhì)，其熒光比普通熒光持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。普通熒光的半衰期為納秒級(jí)（ns），鑭系元素的半衰期為毫秒級(jí)（ms），有6個(gè)數(shù)量級(jí)的差別。5/8/20247均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR:時(shí)間分辨在檢測(cè)時(shí)，TR有一個(gè)時(shí)間延遲約100微秒，經(jīng)過(guò)這個(gè)時(shí)間延遲，普通熒光的信號(hào)幾乎為零。因此TR的背景非常低，反映樣品實(shí)際情況。5/8/20248均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRET：時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移Donorlong-live

fluorescence(ms)Acceptorshort-livefluorescence(whennotengagedinFRET)(ns)340nm665nmSpectralselectivityEu3+

orTb3+

cryptateXL665ord2Temporalselectivity5/8/20249均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRET優(yōu)勢(shì)將FRET的均相實(shí)驗(yàn)方式和TRF的低背景特點(diǎn)融合在一起，使得TR-FRET技術(shù)擁有操作簡(jiǎn)單、通量大、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠、假陽(yáng)性率較低的優(yōu)勢(shì)；采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)能夠顯著減少實(shí)驗(yàn)體系的干擾，最終的信號(hào)與產(chǎn)物形成的量成比例。TR-FRET技術(shù)也可以取代大部分ELISA，因?yàn)門R-FRET具有同等的檢測(cè)范圍和檢測(cè)極限，而且更節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且不需要洗板的步驟，所以該技術(shù)近年來(lái)已被應(yīng)用于抗體的活性檢測(cè)。5/8/202410均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRET舉例分享TR-FRET競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定人源RANKL單抗拮抗RANKL與RANK結(jié)合活性。5/8/202411均相免疫分析技術(shù)Bindingssay試劑選擇Anti-TagReagents

Europium

Terbium XL665d2

Anti-GST(GSS11)

Anti-6HIS(HIS-1)

Anti-c-myc(9E10)

Anti-FLAG

(M2)

Anti-HA(HAS01)

AntiMBP

Anti-DNP

Anti-ImmunoglobulinReagents

Europium XL665 Anti-humanIg

(&d2)

Anti-mouseIg

(&d2)

Anti-rabbitIg

ProteinA

AffinityReagents

EuropiumXL665 Streptavidin (&Tb) (&d2)

LabelingkitsEuropium Lumi4?-Terbium d2

5/8/202412均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRET舉例分享TR-FRET競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗體拮抗RANKL與RANK拮抗活性Donor：Streptavidin-Eu，重組人RANK標(biāo)記Biotin，重組人RANKL標(biāo)記上Acceptor，620nm和665nm檢測(cè)RANKL與RANK結(jié)合信號(hào)。加入梯度稀釋的Sample（抗體），抗體與RANKL結(jié)合，可拮抗FRET信號(hào)的產(chǎn)生。隨著抗體濃度的梯度增加，熒光信號(hào)呈現(xiàn)劑量曲線關(guān)系。加入抗體5/8/202413均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRET舉例分享TR-FRET競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性曲線圖譜檢測(cè)：340nm激發(fā)光分別讀取620nm和665nm熒光信號(hào)關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置為：Lagtime=50μs-150μs，

Integrationtime=200μs-400μs。擬合DeltaF%vsconcentration的曲線數(shù)據(jù)處理：所得數(shù)據(jù)需要轉(zhuǎn)換成DeltaF%，DeltaF%的計(jì)算方法為：Ratio=Signal665nm/Signal620nmDeltaRatio=Sample(orSTD)Ratio-NCRatioDeltaF%=DeltaRatio/NCRatio*100NC為negativecontrol；EC50=C×[2(1/G)-1](1/B)5/8/202414均相免疫分析技術(shù)BindingssayTR-FRET缺陷分子間有效距離受限，不易檢測(cè)較低信號(hào)水平。5/8/202415均相免疫分析技術(shù)Bindingssay利用供體微珠（Donorbeads）和受體微珠（Acceptorbeads）來(lái)檢測(cè)生物分子的相互作用，微珠表面覆蓋了一層水凝膠，作為生物連接的功能基團(tuán)。供體微珠含有光敏劑-酞菁，在680nm的光照射后將它周圍環(huán)境中的氧分子轉(zhuǎn)化為高能活躍的氧狀態(tài)-單體氧。單體氧在其4μs的半衰期內(nèi)可在溶液中擴(kuò)散高達(dá)200nm的距離。如果在該范圍內(nèi)存在受體微珠，單體氧再與鄰近的受體微珠上的二甲基噻吩化合物產(chǎn)生化學(xué)冷光反應(yīng)，產(chǎn)生冷光效應(yīng)(波長(zhǎng)大約370nm)，繼而通過(guò)激發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終讓受體微珠在520-620nm產(chǎn)生熒光信號(hào)。如果兩種微珠的距離超過(guò)200nm，單體氧無(wú)法擴(kuò)散到受體微珠，則不會(huì)有信號(hào)的產(chǎn)生。在680nm波長(zhǎng)的激發(fā)下，每個(gè)供體微珠能夠釋放60,000單體氧每秒，產(chǎn)生非常高的信號(hào)放大。由于單體氧非常不穩(wěn)定，此反應(yīng)相當(dāng)快速僅4μs，加上供體微珠和受體微珠距離超過(guò)200nm，反應(yīng)隨之下降，所以只有抗原抗體分子結(jié)合才能觸發(fā)反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定熒光量來(lái)反映抗體的活性。

Alpha—AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測(cè)5/8/202416均相免疫分析技術(shù)BindingssayAlphaALPHA技術(shù)包括AlphaLISA和AlphaScreen兩種檢測(cè)方法。兩種方法都使用同一種供體微珠，但使用不同的受體微珠。5/8/202417均相免疫分析技術(shù)BindingssayAlphaScreenbeadsSiNNNNNNNNOSiSiODonor:Phthalocyanine（酞菁）O2680nmDO1g2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2OSNOSNOOenergytransferOSNOO1DgO2340-350nmAcceptorbeads檢測(cè)波長(zhǎng):520-620nmDonorbeads450-500nm1O2SignalAmplificationAlphaScreen受體微珠上包埋了三種染料：二甲基噻吩，蒽和紅熒烯。最終發(fā)光的熒光染料紅熒烯會(huì)在520-620nm的波段發(fā)出可檢測(cè)光。5/8/202418均相免疫分析技術(shù)BindingssayAlphaLISAbeadsSiNNNNNNNNOSiSiODonor:Phthalocyanine（酞菁）O2680nmDO1g2AlphaLISAbeads檢測(cè)波長(zhǎng):607-623nmDonorbeads1O2SignalAmplificationOSNOSNOO1DgO2OSNenergytransferOSNOO1DgO2Europium在AlphaLISA受體微珠中，蒽和紅熒烯被一種鑭系元素銪(Europium)螯合物替代。被激發(fā)的銪螯合物可以在615nm左右形成波段更窄的更強(qiáng)的可檢測(cè)光。該反應(yīng)的半衰期為0.3秒，可使用時(shí)間分辨的方法檢測(cè)。5/8/202419均相免疫分析技術(shù)BindingssayAlphaLISA和AlphaScreen發(fā)射光譜對(duì)比與AlphaScreen相比，AlphaLISA受體微珠的信號(hào)更強(qiáng)，受到介質(zhì)干擾更少。5/8/202420均相免疫分析技術(shù)BindingssayALPHA優(yōu)勢(shì)：均相體系、快速、穩(wěn)定，避免了空間位阻影響生物分子的相互結(jié)合，適用于高通量篩選；具有非常高的靈敏性。信號(hào)的產(chǎn)生是一系列的串聯(lián)反應(yīng)，由于其供體微珠上含有高濃度的感光材料以及受體微珠上含有的高密度二甲基噻吩衍生物和熒光素，在680nm波長(zhǎng)的激發(fā)下，每個(gè)供體微珠能夠釋放60,000單體氧每秒，產(chǎn)生非常高的信號(hào)放大。通過(guò)這種串聯(lián)放大反應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)大信號(hào)，能夠檢測(cè)到高達(dá)亞皮摩爾級(jí)別的化合物活性；具有非常低的背景。長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)，短波長(zhǎng)發(fā)射，不會(huì)有自發(fā)光熒光的干擾。檢測(cè)模式為時(shí)間分辨熒光，能夠消除幾乎所有的來(lái)自體系或者板子熒光背景，進(jìn)一步降低了背景，確保結(jié)果的真實(shí)性；具有高信噪比。由于其較高的信號(hào)值以及較低的背景值，所以具有很高的信噪比；ALPHA技術(shù)還具有靈活多變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其檢測(cè)的范圍既可以是低親和力的結(jié)合，也可以是強(qiáng)親和力的結(jié)合。無(wú)論是酶的活性實(shí)驗(yàn)，還是受體配體反應(yīng)，第二信使水平的檢測(cè)，GPCR的功能研究，DNA，RNA，蛋白質(zhì)，多肽，糖類，小分子，大分子以及巨大結(jié)構(gòu)的復(fù)合物等等的復(fù)合物相互作用都可以通過(guò)ALPHA技術(shù)來(lái)檢測(cè)。絕大多數(shù)的ELISA實(shí)驗(yàn)都可以輕松地轉(zhuǎn)換ALPHA技術(shù)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。5/8/202421均相免疫分析技術(shù)BindingssayAlpha舉例分享AlphaScreen競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定人源PD1單抗拮抗PDL1與PD1結(jié)合活性5/8/202422均相免疫分析技術(shù)Bindingssay試劑選擇5/8/202423均相免疫分析技術(shù)BindingssayAlphaScreen舉例分享StreptavidinDonor；NichelateAlphaScreenAcceptor；重組人PDL1標(biāo)記Biotin;His標(biāo)簽重組人PD1;檢測(cè)PDL1與PD1的結(jié)合信號(hào)。加入梯度稀釋的Sample（抗體），可拮抗熒光信號(hào)的產(chǎn)生，并且呈現(xiàn)劑量曲線關(guān)系。熒光信號(hào)對(duì)濃度擬合曲線，可得EC50，標(biāo)準(zhǔn)品EC50與樣品EC50的比即是相對(duì)拮抗活性。AlphaScreen競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗體拮抗PDL1