基因表達分析技術

基因表達分析技術METHODSFORANALYZINGGENEEXPRESSION1基因表達分析技術5/8/2024基因mRNA蛋白質多肽鏈基因表達2基因表達分析技術5/8/2024一、通過檢測mRNA揭示基因轉錄水平的表達特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法:例如DNA微陣列、Northern印跡、實時RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法:

如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。這里主要針對已知基因的常用表達分析方法做一介紹。3基因表達分析技術5/8/2024（一）基于雜交原理檢測mRNA的表達水平1．Northern印跡（Northernblot）※是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術※指將RNA變性及電泳分離后，并轉移到固相支持物上，用雜交反應來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。4基因表達分析技術5/8/2024三種印跡技術的比較5基因表達分析技術5/8/2024RNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S6基因表達分析技術5/8/2024分子雜交實驗7基因表達分析技術5/8/2024放射自顯影照片目錄8基因表達分析技術5/8/20242．核糖核酸酶保護實驗（ribonucleaseprotectionassay，RPA）是靈敏度和特異性很高的mRNA定量分析方法基本原理是將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針與目的RNA結合，形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化；而未結合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。9基因表達分析技術5/8/2024RPA基本程序：●待測RNA的分離●體外轉錄標記RNA探針●待測RNA與探針RNA進行液相雜交●RNA酶消化●不同大小雜交片段凝膠電泳分離10基因表達分析技術5/8/2024核糖核酸酶保護實驗原理示意圖32P標記的探針：雜交雙鏈進行變性PAGE，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測探針的信號；生物素標記的探針：雜交雙鏈經(jīng)過變性PAGE后，電轉移至尼龍膜，用鏈霉親和素－辣根過氧化物酶和化學發(fā)光底物與膜上biotin標記的探針結合，X射線膠片或化學發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。11基因表達分析技術5/8/2024RPA比NorthernBlot的優(yōu)勢：1.過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應更加完全2.RPA比NorthernBlot靈敏15－150倍，適合檢測各種表達水平之基因3.RPA通量高，同時檢測多個基因，可評價他們在同一情況下的差異表達4.一次RPA就能完成10多次NorthernBlot的工作，加快研究速度12基因表達分析技術5/8/2024可細胞或組織中原位表達的mRNA進行區(qū)域定位標記探針特異性地與目標靶mRNA序列雜交，檢測標記信號來確定基因在組織和細胞內表達的區(qū)位信息。可作為定量分析的補充。3．原位雜交（insituhybridization，ISH）13基因表達分析技術5/8/2024原位雜交技術主要步驟：材料處理及細胞樣品的固定；樣品的制備和預處理；探針的制備和預雜交；探針及樣品的變性；雜交溫育；檢測雜交信號，進行結果分析。14基因表達分析技術5/8/2024（二）RT-PCR常用的mRNA檢測方法1．反轉錄PCR可用于mRNA的半定量分析

反轉錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）它以mRNA為模板，體外擴增cDNA，再以cDNA為模板進行特定基因轉錄產(chǎn)物的PCR擴增。RT-PCR技術一般用于RNA的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。反轉錄實時定量PCR15基因表達分析技術5/8/2024逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增16基因表達分析技術5/8/2024PCR技術原理17基因表達分析技術5/8/20245

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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一、基本工作原理目錄18基因表達分析技術5/8/2024Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄19基因表達分析技術5/8/2024模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分20基因表達分析技術5/8/2024PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C21基因表達分析技術5/8/2024實驗儀器電泳儀22基因表達分析技術5/8/2024瓊脂糖凝膠電泳槽23基因表達分析技術5/8/2024PCR儀24基因表達分析技術5/8/2024PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點25基因表達分析技術5/8/2024實驗結果PCR結果。1、對照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）26基因表達分析技術5/8/2024凝膠成像系統(tǒng)27基因表達分析技術5/8/2024TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon28基因表達分析技術5/8/2024常規(guī)PCR方法的局限性分析：無法對起始模板準確定量,只能對終產(chǎn)物進行分析必須在擴增后用電泳方法分析,費時費力而且EB有毒無法對擴增反應實時檢測29基因表達分析技術5/8/20242、實時熒光定量PCR

（real-timePCR）30基因表達分析技術5/8/2024非特異性的嵌入熒光染料

（Non-specificDNAbindingdyes）SYBR?GreenISYBR?GoldEthidiumBromide31基因表達分析技術5/8/2024Extension5’3’5’3’5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’RepeatDNAbindingdyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll32基因表達分析技術5/8/2024實時PCR技術原理目錄33基因表達分析技術5/8/2024非特異性的嵌入熒光染料評價優(yōu)點：與特異性的熒光探針相比價格便宜只需要設計PCR引物缺點：由于它和模板的結合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴增產(chǎn)物結合，不能真實反映目的基因的擴增情況。34基因表達分析技術5/8/2024TaqMan探針評價優(yōu)點：熒光信號強與其它探針相比設計簡單可用于多通道檢測可用于SNP的檢測缺點：比DNA結合染料價格高35基因表達分析技術5/8/2024CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheoryCt值（ThresholdCycle）

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物熒光信號超過基線值（進入指數(shù)增長期）時的循環(huán)數(shù)。36基因表達分析技術5/8/2024

模板起始濃度越高，Ct值越小

Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系Ct值與模板起始濃度的關系

如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個循環(huán)到達如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個循環(huán)到達37基因表達分析技術5/8/2024絕對定量可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度

利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。38基因表達分析技術5/8/202439基因表達分析技術5/8/20243、原位PCR技術40基因表達分析技術5/8/2024原位ＰＣＲ

原位聚合酶鏈式反應（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產(chǎn)物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行ＰＣＲ擴增?？蛇M行細胞內定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列41基因表達分析技術5/8/202416塊載玻片及24個0.2ml管的樣品block42基因表達分析技術5/8/202443基因表達分析技術5/8/2024操作步驟1.細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）2.PCR擴增細胞內目的片段3.原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達44基因表達分析技術5/8/2024DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上

。4、基因芯片分析基因表達譜（高通量地分析基因表達）基因芯片(genechip)45基因表達分析技術5/8/2024目錄46基因表達分析技術5/8/2024二、通過蛋白質檢測揭示基因翻譯水平的表達特征

Western印跡（Westernblot）是一種免疫印跡技術，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標記物的抗體分子作為探針，檢測轉移到固相支持物上的蛋白質/多肽分子。當在蛋白質水平上檢測特定基因的表達活性時，最常用的方法就是利用Western印跡對細胞或組織的總蛋白質中的特異蛋白質進行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體經(jīng)Western印跡可直接測定基因編碼多肽47基因表達分析技術5/8/2024蛋白質樣品的制備SDS分離蛋白質轉膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質（抗原）印跡雜交再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）最后經(jīng)與酶的底物反應而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Westernblot基本程序48基因表達分析技術5/8/202449基因表達分析技術5/8/202450基因表達分析技術5/8/202451基因表達分析技術5/8/2024WestBlot52基因表達分析技術5/8/2024受檢標本+固相載體表面的抗原或抗體起反應——結合特異抗體（一抗）酶連接的第二抗體（也可預先包被抗體，“吸附”抗原），再進行酶-底物反應。反應后通過專門的酶標儀測定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）53基因表達分析技術5/8/2024特點：1、具有特異性；2、靈敏度很高；3、穩(wěn)定、操作簡便，標本用量少，適于大規(guī)模篩查，尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；4、既可以做定性試驗也可以做定量分析。

酶聯(lián)免疫吸附分析54基因表達分析技術5/8/2024

免疫組織化學（immunohistochemistry）是利用標記的特異性抗體通過抗原-抗體反應和顯色反應，在組織或細胞原位檢測特定抗原（即目標蛋白質）的方法，簡稱為免疫組化實驗。近年來由于熒光標記抗體的廣泛應用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為免疫熒光法。（三）免疫組化實驗對組織/細胞表達的蛋白質進行原位檢測55基因表達分析技術5/8/202456基因表達分析技術5/8/2024人皮膚角化細胞免疫熒光染色

57基因表達分析技術5/8/2024（immunofluorescence），可應用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（confocalmicroscopy）對靶分子進行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進行斷層成像，是在蛋白質水平分析基因表達的直觀方法。其中抗體對于蛋白質靶點的特異性、種間交叉反應、檢測系統(tǒng)的靈敏性以及細胞或組織的固定類型是該方法的關鍵因素。運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進行檢測，是一種揭示更多有關細胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術，若結合密度計量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。58基因表達分析技術5/8/2024

流式細胞術（flowcytometry）在細胞水平分析特定蛋白質的基本原理也是抗原-抗體反應，它利用熒光標記抗體與抗原的特異性結合，經(jīng)過流式細胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細胞表達特定蛋白質的水平對某種蛋白質陽性細胞（即特異基因表達的細胞）作出判斷。（四）流式細胞術用于分析細胞特異表達的蛋白質59基因表達分析技術5/8/2024流式細胞術可以檢測活細胞，也可以檢測用甲醛固定的細胞。廣泛應用于細胞表面和細胞內分子表達水平的定量分析，并能夠根據(jù)各種蛋白質的表達模式區(qū)分細胞亞群。此外，流式細胞術可以使用多個熒光標記的抗體同時對多個基因產(chǎn)物進行標記和監(jiān)測，是對細胞進行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。60基因表達分析技術5/8/2024是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復雜生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質-蛋白質/DNA-蛋白質/RNA-蛋白質，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、小分子-蛋白質等的相互作用（五）蛋白質芯片分析蛋白質表達譜（高通量地分析基因表達）蛋白質芯片(proteinchip)61基因表達分析技術5/8/2024蛋白質檢測芯片包括:抗體芯片抗原芯片配體芯片等62基因表達分析技術5/8/2024

目前比較和鑒定蛋白質表達譜更多采用雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis,簡稱2-D電泳）結合質譜技術。

原理:

根據(jù)蛋白質分子的兩個屬性——等電點和分子質量——將蛋白質混合物進行分離。電泳結果經(jīng)染色后，即可對不同樣品中蛋白質的表達譜進行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質點切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用質譜（massspectrum）技術進行定性分析，對差異表達的蛋白質進行鑒定。可同時分離數(shù)成百上千的蛋白質。（六）雙向電泳結合質譜普遍用于蛋白質表達譜的分析和鑒定63基因表達分析技術5/8/2024

雙向電泳技術Two-dimemsionalgelelectrophoresis,2DE技術構成：第一相：IEF采用丙烯酰胺與不同PH的兩性 電介質形成的固定的PH梯度–IEF-

PAGE第二相：分子篩凝膠SDS-PAGE特點：1.一次分離細胞中幾乎所有的蛋白質（以spot形式出現(xiàn)）2.高靈敏度和高分辨率用銀染條件下，可達10-15——10-18mol水平3.便于計算機分析處理電泳分離圖譜經(jīng)掃描輸入計算機，可以進行蛋白質定位,

等電點,分子量定量不同條件下的圖譜進行比較,建立蛋白質組數(shù)據(jù)庫64基因表達分析技術5/8/202465基因表達分析技術5/8/202466基因表達分析技術5/8/202467基因表達分析技術5/8/202468基因表達分析技術5/8/2024質譜技術

質譜儀進樣系統(tǒng)離子源質量分析器離子探測器系統(tǒng)69基因表達分析技術5/8/2024在蛋白質組學研究中常用的質譜儀電噴霧離子化質譜儀（ESI-MS）基質輔助的激光解吸離子化－飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）四極桿-TOF質譜儀（Q-TOF）70基因表達分析技術5/8/2024質譜技術在蛋白質組研究中的作用1.肽質譜和肽的序列分析2.翻譯后修篩的蛋白質鑒定

N端封閉，磷酸化，糖基化3.其它： 蛋白質二硫鍵的定量和定位 蛋白質——蛋白質相互作用的分析 蛋白質——其它分子相互作用的分析 蛋白質二級結構的分析 比較不同條件（正常細胞與異常細胞，不同發(fā)育階段從中獲得單個有價值的蛋白質結構與功能71基因表達分析技術5/8/2024標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖72基因表達分析技術5/8/2024

白質相互作用研究領域里得到極大的推廣。GST融合蛋白在經(jīng)過固定有GST(glutathione)的色譜柱時，就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附。當再有細胞抽提物過柱，就