鯉魚(yú)的人工孵化及精子的短期保存

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚(yú)類精子的短期儲(chǔ)存是一種簡(jiǎn)單而廣泛使用的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于各種經(jīng)濟(jì)和瀕危物種的人工繁殖。精子的短期儲(chǔ)存是指精子在低溫下保存數(shù)小時(shí)到數(shù)天的時(shí)間，同時(shí)精子保持其運(yùn)動(dòng)和受精能力的潛力。然而，精子在貯藏期間會(huì)發(fā)生表型、生理和遺傳或表觀遺傳的變化，從而影響其受精能力和后代的性能。本文綜述了鯉魚(yú)精子短期儲(chǔ)存的研究進(jìn)展，并對(duì)影響鯉魚(yú)精子活力和受精能力的因素進(jìn)行了探討。一

鯉魚(yú)的人工孵化1.精子和卵子的產(chǎn)生鯉魚(yú)雄性每年每千克體重產(chǎn)生（1.9±0.2）×1012個(gè)精子，其中95%以上可以在激素誘導(dǎo)后獲得受精活性，精子濃度在15×109-32×109個(gè)精子/mL的范圍內(nèi)。研究表明，精子濃度值根據(jù)品種的不同而變化更大，平均值在7.9×109-19.6×109個(gè)精子/mL之間。雌性具有高繁殖力，每千克體重產(chǎn)10萬(wàn)至30萬(wàn)個(gè)卵。人工產(chǎn)卵期間，鯉魚(yú)的生殖力通常較低，雌性生殖力每千克體重產(chǎn)卵數(shù)量范圍從4.1萬(wàn)到8.6萬(wàn)個(gè)不等，卵的直徑和重量分別為1.24~1.42毫米和0.86~1.41毫克。產(chǎn)卵數(shù)量主要取決于季節(jié)、品種、年齡和魚(yú)自身?xiàng)l件等因素。在20~24℃溫度范圍內(nèi)，鯉魚(yú)一年可多次排精及產(chǎn)卵。2.產(chǎn)卵刺激在繁殖過(guò)程中，卵母細(xì)胞和精子的最終成熟是由內(nèi)源或合成激素誘導(dǎo)和同步的。鯉魚(yú)人工孵化的一般方法為：利用鯉魚(yú)垂體誘導(dǎo)精子和排卵，然后采集精子和卵子，卵子和精子的比例是1:20萬(wàn)；用孵化水活化，20℃攪拌2分鐘；去除粘性后，將受精卵轉(zhuǎn)移到適當(dāng)容器中，20~22℃孵育；孵育72-96h后，將孵化出的幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到孵化槽中。為了短期儲(chǔ)存，將收集的精子用補(bǔ)充劑（110mMNaCl+40mMKCl+2mMCaCl?+1mMMgSO?+10mMTris,pH=8，滲透性310mOsm/kg）稀釋后，在有氧條件下保存在冰上（0~2℃），直到進(jìn)一步使用。鯉魚(yú)腦垂體（CP）是最常用的刺激最終配子成熟的因子。每毫克片劑含有5~60μg促黃體生成素（LHRH）。將CP溶解在生理鹽水（0.9%NaCl）中，并在背鰭基部和側(cè)線之間肌內(nèi)注射。雌魚(yú)的有效劑量約為3mg/kg。注射過(guò)程分兩步：首先注射約0.3~0.5mg/kg。首次給藥后12h，再次注射約2.5~2.7mg/kg。雄魚(yú)注射量約為0.5~2.0mg/kg。除CP外，鯉魚(yú)孵化場(chǎng)還使用GnRH類似物，包括哺乳動(dòng)物L(fēng)HRH-A（D-Ala6-Pro9-NET-mGnRH）和鮭魚(yú)GnRH-A（D-Arg6，Pro9-NET-sGnRH），劑量約為10μg/kg。3.人工產(chǎn)卵授精配子成熟后，將親魚(yú)麻醉，通過(guò)朝向尾部的溫和腹部按摩將雌性的卵母細(xì)胞收集在盤(pán)或碗中，然后可以類似地將雄性精液收集并混入卵母細(xì)胞。向精子和卵母細(xì)胞的混合物中加入適當(dāng)體積的激活溶液，如孵化水或鹽溶液（45mMNaCl、5mMKCl、Tris20mM，pH=8），并用羽毛或廚房刮刀混合1-2分鐘，以激活精子活力并確保卵受精。在實(shí)驗(yàn)室條件下，通常使用Bürker細(xì)胞血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算精子濃度，并使用顯微鏡通過(guò)目視觀察控制精子活力。授精的最佳精子稀釋度確定為10?2~10?3。研究表明，使用脫氯自來(lái)水時(shí)，每個(gè)卵母細(xì)胞的最低精子數(shù)可確保良好受精，孵化率范圍為8500至25000。受精后，卵子迅速水合和膨脹。因此，應(yīng)使用含有堿性蛋白酶、全脂奶粉、白色粘土或單寧酸的溶液，在5-60分鐘內(nèi)消除受精卵的粘性。最后將卵在孵化罐（大規(guī)模生產(chǎn)）或培養(yǎng)皿、塑料碗或孵化器（實(shí)驗(yàn)室）中孵育，直到幼蟲(chóng)孵化。二

鯉魚(yú)精子的短期儲(chǔ)存精子短期儲(chǔ)存一般是將精子稀釋到一種叫做“緩沖劑”的溶液或精漿中，使精子在低溫（0~2℃）下保持?jǐn)?shù)小時(shí)至數(shù)天的靜止?fàn)顟B(tài)。精子短期儲(chǔ)存在實(shí)際生產(chǎn)和科學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用和重要意義。例如，當(dāng)雄性親魚(yú)對(duì)激素刺激的反應(yīng)比雌性更快，或者雄性數(shù)量有限，或者需要在養(yǎng)魚(yú)場(chǎng)之間運(yùn)輸精子時(shí)，精子短期儲(chǔ)存就會(huì)發(fā)揮作用。研究表明，精子在體外儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生ATP的成熟和再生，因此短期儲(chǔ)存有助于誘導(dǎo)睪丸精子、不良精子或性別逆轉(zhuǎn)精子的成熟。當(dāng)使用緩沖劑時(shí)，必須將精子以靜止?fàn)顟B(tài)儲(chǔ)存，直到它們用于受精。由于精子在精漿中是不動(dòng)的，因此精漿中的滲透壓是恒定的。在使用緩沖劑的條件下，精子受到保護(hù)，免受滲透損傷，并保持鞭毛跳動(dòng)和受精能力所需的ATP來(lái)源。精子儲(chǔ)存期間的低溫使精子代謝保持在最低水平。然而，如果儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，微生物污染可能會(huì)降低精子的活力和存活率。三

影響精子短期保存的因素1.溫度精子與緩沖劑混合物的溫度會(huì)影響短期儲(chǔ)存的成功率。Ravinder等人報(bào)道了未稀釋的鯉魚(yú)精子在室溫（22℃）和低溫（2℃）下分別儲(chǔ)存20和84小時(shí)后完全失去了運(yùn)動(dòng)潛能，而在5℃的溫度條件下存儲(chǔ)84h后，33%的精子仍可被激活，因此，在5℃和2℃之間的溫度條件對(duì)鯉魚(yú)精子的具體作用機(jī)制值得關(guān)注。在2℃、5℃和22℃保存后，50%精子失去運(yùn)動(dòng)潛能的致死溫度（LT50）分別為40h、55h和2.5h。研究表明，低溫對(duì)于在孵化場(chǎng)短時(shí)間儲(chǔ)存精子是必要的，就像短期儲(chǔ)存在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的各種物種一樣，這是因?yàn)榈蜏叵戮哟x受到抑制，短期儲(chǔ)存的精子軸突跳動(dòng)所需的ATP無(wú)法獲得。2.緩沖劑緩沖劑的化學(xué)成分、滲透性和pH值是短期儲(chǔ)存成功的重要因素，這些因素在精子運(yùn)動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要的生理作用。緩沖劑可保護(hù)精子免受質(zhì)膜、基因組（DNA和表觀基因組）、線粒體和軸突的損傷。因此，精子活力的持續(xù)時(shí)間比未稀釋保存在緩沖劑中的精子延長(zhǎng)。精漿成分的測(cè)定有助于優(yōu)化稀釋劑的成分。精漿含有分別負(fù)責(zé)能量代謝和精子運(yùn)動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)的有機(jī)物和離子成分。Na?、K?和Cl?是精漿的主要離子成分，Na?:K?的比例接近1:1。當(dāng)NaCl、KCl、葡萄糖或甘露醇的滲透壓濃度＜300mOsmol/kg時(shí)，鯉魚(yú)精子活力可以被激活，這表明精子活力啟動(dòng)不需要Na?或K?離子。當(dāng)精子以310mOsmol/kg滲透壓濃度儲(chǔ)存時(shí)，在150mMNaCl中儲(chǔ)存24-72h后，精子活力、速度〔曲線速度（VCL）和直線速度（VSL）〕和搏動(dòng)頻率高于150mMKCl。研究顯示，在110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl?、1mMMgSO?、20mMTris的稀釋液中，精子儲(chǔ)存效果最佳。鯉魚(yú)精漿的pH值在7.5~8.5之間。研究表明，當(dāng)環(huán)境滲透壓觸發(fā)精子運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的堿性pH值是激活動(dòng)力蛋白ATP酶所必需的，其值與細(xì)胞外介質(zhì)（精漿、精漿擴(kuò)展器或激活介質(zhì)）的pH值平行變化。用110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl?、1mMMgSO?、20mMTris以1:9的比例稀釋鯉魚(yú)精子，在pH值為7~9的條件下儲(chǔ)存72h，精子的游動(dòng)百分率、游動(dòng)速度（VCl或VSL）和跳動(dòng)頻率均無(wú)顯著差異。研究表明，鯉魚(yú)儲(chǔ)存的精子在45mMNaCl、5mMKCl、20mMTris、pH7、pH8和pH9條件下被激活時(shí)顯示出相似的運(yùn)動(dòng)百分比，這表明，中性和堿性pH的緩沖劑均可為精子提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，以保護(hù)其運(yùn)動(dòng)潛能。四

精子形態(tài)、生理生化的短期改變1.短期儲(chǔ)存對(duì)精子形態(tài)和數(shù)量的影響報(bào)道了鯉魚(yú)在儲(chǔ)存期間異常精子的增加，并利用掃描和透射電鏡描述了短期儲(chǔ)存精子的幾種形態(tài)改變，這些變化包括核膜脫離、線粒體受損、鞭毛卷曲、軸突中央二重微管缺失等。在精子短期儲(chǔ)存期間，精子運(yùn)動(dòng)和速度的降低是由于質(zhì)膜和線粒體的破壞，而這些質(zhì)膜和線粒體調(diào)控著精子滲透壓依賴性的運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)和ATP依賴性的鞭毛跳動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，精子在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)精子數(shù)量下降的現(xiàn)象，其下降幅度隨稀釋比和添加量的不同而不同。體外保存8天后，1:1稀釋的精子數(shù)量減少了22.9%，而未稀釋的精子數(shù)量減少了50.3%。稀釋成1:1的緩沖劑大大延緩了精子濃度的降低。2.短期儲(chǔ)存對(duì)精子生理生化的影響精子質(zhì)量（魚(yú)齡、產(chǎn)卵季節(jié)、光周期條件和精液收集方法）和儲(chǔ)存條件（溫度、氧氣可用性、稀釋劑成分、儲(chǔ)存時(shí)間）是精子短期儲(chǔ)存成功的關(guān)鍵。這些因素可以改變精子的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生和DNA碎片的增加。氧氣對(duì)所有活細(xì)胞都至關(guān)重要，但其代謝物ROS對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)、速度、新陳代謝、活力喪失和受精潛力等功能有負(fù)面影響。在精子儲(chǔ)存期間，氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS，可以損害質(zhì)膜、線粒體結(jié)構(gòu)和呼吸功能。細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸的存在使精子的精漿和核膜成為ROS的極好靶點(diǎn)，同時(shí)破壞DNA和蛋白質(zhì)ROS誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，增加細(xì)胞滲透性、酶失活和抗?jié)B透性休克能力。線粒體是魚(yú)類精子的主要能量來(lái)源，對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)、完整性和受精潛力具有重要作用。魚(yú)類精子運(yùn)動(dòng)的激活需要線粒體分泌大量ATP，細(xì)胞內(nèi)ATP含量控制著精子運(yùn)動(dòng)期的持續(xù)時(shí)間。然而，沒(méi)有足夠的證據(jù)表明魚(yú)類精子在短期儲(chǔ)存過(guò)程中，細(xì)胞間ATP在線粒體中減少，盡管線粒體的低氧化能力、線粒體膜完整性和線粒體損傷可通過(guò)降低細(xì)胞間ATP含量來(lái)限制精子的運(yùn)動(dòng)周期。