細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程

細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/20241細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/20242細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程課程安排及進(jìn)度5/9/20243細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程實(shí)驗(yàn)課時間：從第14周開始實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)：104館三樓東邊注意事項：1.網(wǎng)上沒有名字的同學(xué)請不要填報實(shí)驗(yàn)課名單。2.現(xiàn)在不能確定自己時間的同學(xué)不要填報，可以下次上課時再報。3.一旦填報就不能再更改時間。5/9/20244細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)四、細(xì)胞分離與純化五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法5/9/20245細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程植塊（explant）：從動物體內(nèi)取出，用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為外植塊或簡稱植塊。分離（散）細(xì)胞［isolated（dissociated）cell］：由組織塊分散后制成的單個細(xì)胞一般稱之～。細(xì)胞懸液（cellsuspension）：單個細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶液中，就稱之～

。幾個名詞和概念：5/9/20246細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程當(dāng)培養(yǎng)物的總體積不斷擴(kuò)大，培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時候，原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求，這時就需要將培養(yǎng)物分成若干小的部分，繼續(xù)培養(yǎng)。因此，按照培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng)，而將體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)或稱初代培養(yǎng)（primaryculture）和繼代培養(yǎng)（secondaryculture)或稱再培養(yǎng)（subculture）兩大類。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程幾個名詞和概念：5/9/20247細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/20248細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程原代培養(yǎng)，通俗地講，就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義：①原代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長器皿；②原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞的“代”數(shù)，原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反，在原代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能經(jīng)歷多次的細(xì)胞分裂活動而產(chǎn)生多個子代細(xì)胞；5/9/20249細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程③原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿，像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法，即便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿，但不更換培養(yǎng)組織細(xì)胞所附著的生長基質(zhì)蓋片，仍屬于原代培養(yǎng)；④植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)有時候在培養(yǎng)物增長到一定程度后，也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再培養(yǎng)。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202410細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細(xì)胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202411細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1）準(zhǔn)備工作：（2）制備基本步驟（技術(shù)路線）：主要是取材器具、用品的滅菌以及實(shí)驗(yàn)者、實(shí)驗(yàn)動物的清潔與消毒。１、取材及培養(yǎng)材料的制備：二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202412細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程大塊組織洗去血污剔除多余成分切成約1mm3大小的植塊植塊培養(yǎng)將所取組織剪碎蛋白酶溶液消化機(jī)械方法吹打組織塊不銹鋼網(wǎng)篩過濾過濾液離心用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度培養(yǎng)分離的細(xì)胞二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）基本步驟（技術(shù)路線）：（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202413細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、取材及培養(yǎng)材料的制備：二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程關(guān)于取材：（1)取材要準(zhǔn)確：取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在這最初的實(shí)驗(yàn)過程中沒有取到合格、理想的實(shí)驗(yàn)材料，整個體外培養(yǎng)過程就很難達(dá)到預(yù)期的目的。(2)關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟：就動物不同組織的取材而言，取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中，還需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況做一些調(diào)整。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202414細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細(xì)胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202415細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1）機(jī)械解離細(xì)胞法：

1）吸管吹打法--2）過篩法--（2）酶學(xué)解離細(xì)胞法：

1）胰蛋白酶離解細(xì)胞法--2）膠原酶離解細(xì)胞法--（3）螯合劑解離細(xì)胞法：

常用螯合劑：乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na）、檸檬酸鈉、枸櫞酸鈉。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程２、分離（散）細(xì)胞的方法：（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202416細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細(xì)胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202417細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程接種（seeding）也稱種植(plating)或體外移植(explantation),實(shí)際上就是將取材并切割好的組織塊（植塊）或者分離好的細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。如果將準(zhǔn)備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進(jìn)行培養(yǎng)，就稱為植塊培養(yǎng)。體外移植的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的情況。如果將所制備的細(xì)胞懸液用于種植和培養(yǎng)，就稱為分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202418細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞如果屬于貼壁依賴型細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長基質(zhì)表面才能生長，這樣的細(xì)胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長滿一層，當(dāng)培養(yǎng)物長滿培養(yǎng)器皿的表面時即會因?yàn)榻佑|抑制而停止生長，這種培養(yǎng)方式就稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（single-layercellculture)。如果所培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性，在懸浮狀態(tài)下即可以生長和繁殖，這樣的培養(yǎng)方式就稱為懸浮（細(xì)胞）培養(yǎng)（suspensionculture）。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202419細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1）植塊培養(yǎng)：植塊培養(yǎng)是比較簡單的培養(yǎng)方法，其技術(shù)要點(diǎn)就是將從動物體內(nèi)所取得的組織切割成一定大小的植塊，再將植塊接種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個，其一是觀察植塊的組織學(xué)生長行為，其二是通過植塊培養(yǎng)，讓構(gòu)成植塊的細(xì)胞從植塊內(nèi)遷移出來并在植塊外分裂增殖，然后將植塊去除，從而得到細(xì)胞培養(yǎng)物。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202420細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)：相對于植塊培養(yǎng)法，分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是：解除了植塊內(nèi)細(xì)胞之間的“組織關(guān)系”，從而可以反映出單個細(xì)胞的生物學(xué)特征。借助分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)法，還可以分離(isolate)或純化某一類型的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對單一細(xì)胞類型（monotypiccellculture）進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。動物組織的大多數(shù)細(xì)胞類型都屬于貼壁（錨定）依賴型細(xì)胞（anchorage-dependentcell)。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202421細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3）生長基質(zhì)：生長基質(zhì)（growthsubstratum）泛指培養(yǎng)物附著的各種介質(zhì)，狹義特指在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。一般來說，國際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿，其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動物細(xì)胞體外生長。只有少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細(xì)胞，需給予提供包被有特殊生長基質(zhì)物質(zhì)的生長表面。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202422細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、接種與培養(yǎng)過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspensioncellculture）對于有些細(xì)胞來說，其生長不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如，某些白血病細(xì)胞、某些腹水瘤細(xì)胞等。體外培養(yǎng)這種細(xì)胞時，可以通過對培養(yǎng)液以及其中的細(xì)胞進(jìn)行不斷攪拌，或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。也有一些細(xì)胞無須攪拌或用搖床搖動，只要在培養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)方法就稱為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202423細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、取材及培養(yǎng)材料的制備２、分離（散）細(xì)胞的方法３、接種與培養(yǎng)過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202424細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程４、更換培養(yǎng)液二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程隨著培養(yǎng)的進(jìn)程，營養(yǎng)物被消耗，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物愈來愈多，尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng)，釋放出的CO2及其它酸性代謝產(chǎn)物（如乳酸和丙酮酸）越來越多，培養(yǎng)液的pH值越來越低，培養(yǎng)液的顏色越來越黃。根據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化確定換液的間隔時間是很有實(shí)際意義的。營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細(xì)胞數(shù)量。隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù)，細(xì)胞會分裂增生，數(shù)量增加，換液的時間間隔就可能越來越短。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202425細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項（1）關(guān)于培養(yǎng)液：1)培養(yǎng)基的選擇：培養(yǎng)某一種細(xì)胞，到底選用哪一種培養(yǎng)基，需要根據(jù)細(xì)胞的生長情況摸索確定。2）添加物：選擇好培養(yǎng)基類型以后，還要摸索需要補(bǔ)加的成分及其添加量。3)培養(yǎng)液的酸堿度：普通動物細(xì)胞一般適宜的pH范圍為7.2－7.4當(dāng)pH值低于6.8時，會對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。4)換液：換液時，如果細(xì)胞密度很低或者細(xì)胞的生長較為緩慢，可以不完全更換培養(yǎng)液，只吸出一半的舊培養(yǎng)液，補(bǔ)加相同體積的新培養(yǎng)液即可。培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至370C。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202426細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項（2）關(guān)于培養(yǎng)空間：培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的空間，包括液相環(huán)境與氣相環(huán)境兩方面。調(diào)整培養(yǎng)空間的主要目的是改變對培養(yǎng)物的供氧量。一般來說，培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例以1：10為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在2～5mm的范圍。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202427細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項（3）其它方面：必須根據(jù)不同細(xì)胞生命力的不同以及對環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)能力的不同，選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。除了所培養(yǎng)細(xì)胞自身的活力外，原代培養(yǎng)不成功最大的可能性有兩點(diǎn)：其一是在對組織分散并分離細(xì)胞的過程中嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞，其二是給細(xì)胞提供的體外生長環(huán)境，尤其是生長基質(zhì)與培養(yǎng)液條件不合適。（一）原代培養(yǎng)（primaryculture）5/9/202428細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202429細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再次培養(yǎng)。只要是將培養(yǎng)物從一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個器皿之內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)就算傳代。即便是按“一傳一”的比例進(jìn)行傳代。5/9/202430細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2、傳代的過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202431細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物：植塊培養(yǎng)物生長一定時間之后，從植塊內(nèi)長出（outgrowing）的細(xì)胞會越來越多，遷移出來的細(xì)胞也會不斷分裂繁殖，逐漸長滿所附著的生長基質(zhì)表面，細(xì)胞之間逐漸發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象。若不將原代培養(yǎng)物分割再進(jìn)行培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)物可能會停止生長。1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202432細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物：對于貼壁依賴型細(xì)胞來講，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞分裂增殖，數(shù)量愈來愈大，逐漸會在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整的細(xì)胞層，細(xì)胞之間因接觸性抑制作用而停止生長，此時便需要進(jìn)行傳代。判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標(biāo)就是觀察培養(yǎng)物是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁。1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202433細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3）懸浮培養(yǎng)物：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞的生存空間會越來越小，營養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張，代謝產(chǎn)物積聚，培養(yǎng)環(huán)境逐漸不適應(yīng)細(xì)胞的生長，因而需要傳代。1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202434細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2、傳代的過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202435細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、傳代的過程（1）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物：（貼壁依賴型細(xì)胞）1）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒）；2）漂洗：1~2次，3）離解細(xì)胞：4）終止消化：5）吹打分離細(xì)胞：6）離心：7）重新懸浮、計數(shù)：8）分裝：9）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202436細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2）懸浮培養(yǎng)物：無需分割培養(yǎng)物。1）離心：2）重新懸浮、計數(shù)：3）分裝：4）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、傳代的過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202437細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、傳代的過程（3）植塊培養(yǎng)物：對這種培養(yǎng)物，僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。由于它們一般是種植在生長基質(zhì)蓋玻片上，再培養(yǎng)時一般不更換生長基質(zhì)蓋玻片，只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物，而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202438細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2、傳代的過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202439細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項：根據(jù)不同細(xì)胞的承受能力；選擇合適的時間；采用適當(dāng)?shù)姆椒?。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202440細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項（1）傳代的時機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度：不要急于傳代是對大多數(shù)生命力較為脆弱的細(xì)胞體外培養(yǎng)的上策。除非需要利用傳代實(shí)現(xiàn)其它的目的，如通過傳代對培養(yǎng)物中的混合細(xì)胞進(jìn)行分離。由于在體時細(xì)胞之間的相互作用有利于細(xì)胞的生存和生命活動，因而在進(jìn)行體外分離細(xì)胞培養(yǎng)時盡量給細(xì)胞提供相互作用的條件。一個重要的方法就是增大接種的細(xì)胞密度，使培養(yǎng)的細(xì)胞盡快發(fā)生相互作用。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202441細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程3、傳代培養(yǎng)的注意事項（2）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長：傳代數(shù)或代數(shù)（passagenumber）是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。用它可以相對地衡量某一培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡（cultureage）。經(jīng)過一次傳代，細(xì)胞的生長環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體外生長的細(xì)胞若處于“動蕩”的生活環(huán)境中，其生物學(xué)性狀往往容易發(fā)生改變，尤其是細(xì)胞的遺傳特性可能會發(fā)生改變。應(yīng)該認(rèn)識到，傳代對細(xì)胞生長和性狀是有影響的，在必要性不強(qiáng)的情況下，少傳代為上。（二）繼代培養(yǎng)（secondaryculture）5/9/202442細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202443細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)這里要介紹的是，體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運(yùn)用的、具有代表性的基本方法和技術(shù)。這些基本的方法和技術(shù)有的還在使用，有的則已不常使用，代之以一些改良的方法和技術(shù)。5/9/202444細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)1、懸滴培養(yǎng)法2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法3、蓋玻片培養(yǎng)法4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法5、灌注小室培養(yǎng)法6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法7、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法8、克隆培養(yǎng)法9、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)10、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法11、微囊培養(yǎng)技術(shù)5/9/202445細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程2、培養(yǎng)瓶（cultureflask）培養(yǎng)法凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可以叫做培養(yǎng)瓶。早期的培養(yǎng)瓶主要是玻璃培養(yǎng)瓶，如今國外主要用一次性使用的塑料培養(yǎng)瓶?？ㄊ掀浚╟arlsberg'sflask）

北京瓶塑料培養(yǎng)瓶所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法，就是將擬培養(yǎng)對象直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種培養(yǎng)法只是強(qiáng)調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。5/9/202446細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程卡氏瓶北京瓶經(jīng)典的培養(yǎng)瓶5/9/202447細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法過去曾被稱為微量培養(yǎng)法（microculture）：是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。它是將所培養(yǎng)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，使得細(xì)胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進(jìn)行，使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。培養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿，有極為規(guī)范的商品供應(yīng)。5/9/202448細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程8、克隆培養(yǎng)法（cloningculturetechnique）克?。╟lone）一詞既有名詞意義又有動詞含義。作名詞講時，意指由同一個祖細(xì)胞分裂增生而來的一個子細(xì)胞群，體外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細(xì)胞克隆（cellclone或colony）即為此意。作動詞解時，克隆一詞主要指從同一個祖細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而產(chǎn)生一個子細(xì)胞群的過程，體外培養(yǎng)技術(shù)中的細(xì)胞克?。╟ellcloning）就是這個意思?？寺∨囵B(yǎng)法也可以稱作單細(xì)胞分離培養(yǎng)法（singlecellculture），就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之分裂增殖而產(chǎn)生一個細(xì)胞群的培養(yǎng)方法。5/9/202449細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程克隆培養(yǎng)法最基本的要求是擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細(xì)胞必須是一個細(xì)胞，如此才能獲得具有同一祖先的子細(xì)胞群。

理論上講，各種生物體細(xì)胞都可以進(jìn)行克隆培養(yǎng)，但由于細(xì)胞在體外培養(yǎng)時生長繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時的情況。所以，能夠進(jìn)行克隆培養(yǎng)的細(xì)胞一般只是一些細(xì)胞活力強(qiáng)、增殖能力強(qiáng)、對體外生長環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化（無限）細(xì)胞系、（胚胎）干細(xì)胞以及微生物細(xì)胞等。這些細(xì)胞種類即便是單個細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境，也可以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖，從而形成一群子細(xì)胞。8、克隆培養(yǎng)法（cloningculturetechnique）5/9/202450細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程實(shí)驗(yàn)課時間：從第14周開始實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)：104館三樓東邊注意事項：1.網(wǎng)上沒有名字的同學(xué)請不要填報實(shí)驗(yàn)課名單。2.現(xiàn)在不能確定自己時間的同學(xué)不要填報，可以下次上課時再報。3.一旦填報就不能再更改時間。5/9/202451細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202452細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程在體外培養(yǎng)工作中，為了保種和長期保存培養(yǎng)物的活性，常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，并在需要的時候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存（cryopreservation）：就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇（thawing）：就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。5/9/202453細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷（intracellularice-damage）：是指因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷。

純水（細(xì)胞懸浮其中）

低于零度

結(jié)冰

細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰

冰晶造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡

１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202454細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程溶質(zhì)損傷（solutedamage）或稱溶液損傷（solutiondamage）是指因保存細(xì)胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。溶液（細(xì)胞懸浮其中）溫度下降細(xì)胞外的水分先結(jié)冰在復(fù)溫時，大量水分就會滲入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高細(xì)胞在高溶質(zhì)的溶液中時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細(xì)胞便會發(fā)生滲漏。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202455細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程在溶液中加入冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant)時，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度，降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1～2min內(nèi)恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過長時間，從而不會產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202456細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（１）冷凍速率細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生如下生理變化：*當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃左右時，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低了溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；*當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃～-15℃之間時，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能，其結(jié)果是：細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化學(xué)能的平衡，會向細(xì)胞外流動。是指降溫的速度。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202457細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動的情況就會不同：（1）冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰；（2）冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；（3）冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯瑒t細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（１）冷凍速率5/9/202458細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程超快速玻璃化冷凍：是細(xì)胞存活最理想的冷凍方法。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞；細(xì)胞也不會在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時間過長而受損。不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。所以，在對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高冷凍存活率。

１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（１）冷凍速率5/9/202459細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（２）冷凍保存溫度是指能長久保存細(xì)胞的超低溫度。在超低溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，經(jīng)過長期保存在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。液氮溫度（-196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。在-196℃時，細(xì)胞生命活動幾乎停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能保持完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-196℃均可保存十年以上。應(yīng)用-70℃～-80℃條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯下降。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202460細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（３）復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細(xì)胞存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好。復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)會重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。最佳的復(fù)溫速率與最佳的冷凍速率對保證獲得最佳的凍存效果同等重要。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202461細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（４）冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類：滲透性冷凍保護(hù)劑：可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)。主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酞胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護(hù)劑：不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理5/9/202462細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程滲透性冷凍保護(hù)劑保護(hù)細(xì)胞的機(jī)制是：（1）在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；（2）細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（４）冷凍保護(hù)劑5/9/202463細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程非滲透性冷凍保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制：(假設(shè)有多種)其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（４）冷凍保護(hù)劑5/9/202464細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前，有一種趨勢，就是聯(lián)合使用二種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑（如nMSO）在低溫條件下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫融解后要及時洗除冷凍保護(hù)劑。１、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（４）冷凍保護(hù)劑5/9/202465細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程２、冷凍保存的方法按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化凍存和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存：利角各種溫級的冰箱分階段降溫至-70～-80℃，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-100℃以下，再直接投入液氮進(jìn)行保存的方法。以此種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少有冰晶形成。玻璃化冷凍：則是指利用多種高濃度冷凍保護(hù)劑組合成的玻璃化冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行保存的方法。以此種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液無冰晶形成。5/9/202466細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程３、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇（略）（１）非玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法（２）玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法（略）5/9/202467細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202468細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程與培養(yǎng)無關(guān)的雜質(zhì)混入培養(yǎng)系統(tǒng)稱為污染（contamination）。廣義的污染包括各類微生物的污染、各種培養(yǎng)物間的交叉污染和化學(xué)物質(zhì)的污染。后兩種污染比較容易預(yù)防，而微生物污染的預(yù)防及處理就比較困難，它能直接影響后續(xù)研究工作。通常論及的培養(yǎng)物污染多指各類微生物（包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）對培養(yǎng)細(xì)胞的污染。5/9/202469細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程判斷所培養(yǎng)細(xì)胞是否被微生物污染，可以通過以下方法進(jìn)行確定：目測顯微鏡觀察電鏡檢查特殊染色鑒定微生物培養(yǎng)試驗(yàn)免疫學(xué)分子生物學(xué)等其中，免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法因其快速、敏感和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。１、微生物污染的判斷：5/9/202470細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（１）細(xì)菌（bacterial）的污染及其判斷在細(xì)菌污染培養(yǎng)細(xì)胞的初期，由于受培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的抗生素的作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，這種情況用倒置相差顯微鏡觀察也不易判斷。*將10ml左右的細(xì)胞懸液以1000r/min離心5min，再用無菌的PBS洗滌2次，加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml后，將細(xì)胞置于370C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如果培養(yǎng)物真的受到細(xì)菌的污染，就可以在24h內(nèi)因細(xì)菌的大量繁殖而獲得陽性結(jié)果。5/9/202471細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202472細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：*當(dāng)污染的菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時，大約每20min一代的細(xì)菌增殖速度，會使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅會消耗培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)大量的養(yǎng)分，也能釋放出大量的代謝產(chǎn)物。幾小時之后，增殖的細(xì)菌即可導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀混濁。酸性代謝產(chǎn)物的累積可使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃綠色。（１）細(xì)菌（bacterial）的污染及其判斷5/9/202473細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（２）真菌（eumycete）的污染及其判斷單細(xì)胞真菌稱為酵母菌（yeastfungus）；多細(xì)胞真菌能長出菌絲及孢子并交織成團(tuán)，稱絲狀菌（hyphomycete），又稱霉菌（mycetes）。污染了酵母菌的培養(yǎng)物，類似細(xì)菌污染。在倒置相差顯微鏡下可以觀察到圓形或卵圓形的酵母菌，開啟培養(yǎng)器皿，可聞到像酒或酸的發(fā)酵樣異味。隨著培養(yǎng)液酸度下降，培養(yǎng)液外觀呈現(xiàn)黃綠色。5/9/202474細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（２）真菌的污染及其判斷污染了霉菌的培養(yǎng)物，在倒置相差顯微鏡下能觀察到呈絲狀或樹枝狀生長的菌絲。這些菌絲在培養(yǎng)液中可以長成白色的絲狀團(tuán)塊，如棉絮狀漂浮在培養(yǎng)液中，有的附著在培養(yǎng)器皿或培養(yǎng)物的表面。5/9/202475細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202476細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程5/9/202477細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（３）支原體（mycoplasma）的污染及其判斷受支原體污染的培養(yǎng)細(xì)胞在顯微鏡下無特殊的外觀表現(xiàn)，培養(yǎng)液也不渾濁。由于對支原體污染難以觀察到特殊的外觀變化，要在污染的早期發(fā)現(xiàn)和處理是相當(dāng)困難的。5/9/202478細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程(細(xì)胞碎片)（支原體）5/9/202479細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞較多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時，應(yīng)懷疑培養(yǎng)物可能受支原體污染。必要時應(yīng)借助有關(guān)檢測技術(shù)對培養(yǎng)物進(jìn)行特殊檢測，如DNA熒光染色法、聚合酶鏈反應(yīng)方法、免疫學(xué)方法以及支原體培養(yǎng)法。（３）支原體（mycoplasma）的污染及其判斷5/9/202480細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程（五）培養(yǎng)物的污染二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程１、微生物污染的判斷：（４）病毒（virus）的污染及其判斷細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒污染來源可以是原宿主體細(xì)胞的潛伏性感染，也可以是細(xì)胞膜受體或其它理化方法誘導(dǎo)后進(jìn)入的。判斷培養(yǎng)的細(xì)胞是否被病毒污染，其困難之處在于病毒種類的復(fù)雜性和相應(yīng)的宿主細(xì)胞的特異性。5/9/202481細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本方法和過程感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)學(xué)上不一定有顯著的特異性的改變，因此僅依據(jù)用目測或顯微鏡觀察到的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化來判斷是否受病毒的污染是不充分的。應(yīng)