結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案

結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)5/9/20241結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異的核酸序列；陽(yáng)性結(jié)果提示該檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸的存在，在排除核酸污染的情況下，可確定該檢測(cè)標(biāo)本中存在結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)較常采用的目的片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等第1頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20242結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)

增加分子生物學(xué)陽(yáng)性可以作為確診標(biāo)準(zhǔn)，及強(qiáng)調(diào)病原學(xué)檢查的重要性。3.4.2分子生物學(xué)檢查結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性。4診斷原則肺結(jié)核的診斷是以病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)）檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)的輔助檢查及鑒別診斷等，進(jìn)行綜合分析做出診斷。以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確診依據(jù)。5.3確診病例結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性，及胸部影像學(xué)檢查支持即可確診。第2頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20243結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案常用技術(shù)傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)半巢式全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)基因探針檢測(cè)第3頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20244結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案抗酸染色每張檢查3-5min或更長(zhǎng)時(shí)間→陽(yáng)性率低因素之一熒光染色1.陽(yáng)性率30%2.無(wú)法區(qū)分TB

orNTB1.假陽(yáng)性率高2.結(jié)合抗酸染色第4頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20245結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案結(jié)核菌需要先培養(yǎng)出來(lái)（2-6周）再加入不同濃度抗菌藥物的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-8周報(bào)告藥敏結(jié)果第5頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20246結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案2014年WHO關(guān)于結(jié)核診斷的標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核所有患者，包括兒童，當(dāng)疑似肺結(jié)核并可咳痰時(shí)，應(yīng)送2份痰做涂片鏡檢或1份痰做XpertMTB/RIF檢測(cè)對(duì)于涂陰疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)當(dāng)使用XpertMTB/RIF或培養(yǎng)進(jìn)行診斷耐藥結(jié)核當(dāng)患者具有耐藥結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)，或者合并HIV感染，或者病情嚴(yán)重時(shí)，應(yīng)使用XpertMTB/RIF做初始診斷；肺外結(jié)核所有患者，包括兒童，懷疑有肺外結(jié)核時(shí)，應(yīng)當(dāng)采集相應(yīng)的樣本進(jìn)行微生物學(xué)和組織學(xué)檢查；優(yōu)先推薦使用XpertMTB/RIF做初始診斷第6頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20247結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案GeneXpertXpertMTB/RIF一種半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR體外診斷技術(shù)，可以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌以及利福平耐藥性；針對(duì)rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)引物、探針。5個(gè)探針結(jié)合到野生型，而不是突變體目標(biāo)。每個(gè)探針用不同的熒光染料標(biāo)記，允許同時(shí)檢測(cè)。第7頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20248結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案痰標(biāo)本與處理液1：2混合吸取2ml處理樣品到反應(yīng)盒將反應(yīng)盒放入檢測(cè)模塊（手工操作完成）標(biāo)本自動(dòng)清洗過濾超聲裂解DNA提純DNA和PCR反應(yīng)試劑混合半巢式實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)打印檢測(cè)報(bào)告獲得檢測(cè)結(jié)果時(shí)間：1小時(shí)50分鐘系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成第8頁(yè)/共25頁(yè)5/9/20249結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案INH單耐藥的患者通常不會(huì)考慮立即改變治療方案，與此相反，對(duì)RIF單耐藥的患者，無(wú)論INH是否耐藥，都會(huì)采取與耐多藥患者相同的治療方案1。

約90%利福平耐藥的結(jié)核患者同時(shí)異煙肼耐藥，也就是耐多藥結(jié)核患者2。SvenO.Friedrichetal,.SuitabilityofXpertMTB/RIFandGenotypeMTBDRplusforPatientSelectionforaTuberculosisClinicalTrial.JournalofClinicalMicrobiology.2011(49):2827-2831.

XichaoOuetal.AfeasibilitystudyofXpertMTB/RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina.InternationalJournalofInfectiousDiseases.2015(31):41-46.MTB/RIF檢測(cè)對(duì)MDR-TB的防控“結(jié)核+利福平耐藥”對(duì)多耐結(jié)核控制產(chǎn)生的效果最為顯著。即便補(bǔ)充異煙肼耐藥，能提升的效果有限。第9頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202410結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增儀（TB-LAMP）體外定性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；在恒溫條件下進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)；4種引物識(shí)別6個(gè)區(qū)域，特異性高；擴(kuò)增反應(yīng)效率高，67℃，40min。主要優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器的依賴程度較小，而且試劑成本較低。第10頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202411結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案?jìng)鹘y(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的：定量檢測(cè)人標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌核酸原理：PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的辦法。第11頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202412結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案XpertMTB/RIFTB-LAMP結(jié)核桿菌DNA目的基因片段rpoBgryB及IS6110IS6110方法半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)間2小時(shí)1小時(shí)2.5小時(shí)檢測(cè)敏感度131菌條/ml100菌條/ml1000～10000菌條/ml優(yōu)點(diǎn)全自動(dòng)、同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥基因、特異性高，生物安全性高67℃恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間短，特異性高，生物安全性高適合大批量篩查，低費(fèi)用缺點(diǎn)最多一次同時(shí)檢測(cè)八個(gè)樣本標(biāo)本用量較少，除痰標(biāo)本以外的標(biāo)本需進(jìn)一步認(rèn)證假陽(yáng)性，易污染，需專業(yè)人員操作第12頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202413結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案樣本類型（一）抗酸桿菌涂片鏡檢：

痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本分枝桿菌分離培養(yǎng)：痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本、血液結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)：痰液、支氣管灌洗液、支氣管抽吸物、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本、胃灌洗液、體液、組織、膿腫物、吸出的膿液、創(chuàng)傷標(biāo)本、大便標(biāo)本、血液（GeneXpert除外）、病理切片第13頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202414結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案樣本類型（二）分枝桿菌菌種鑒定

臨床分枝桿菌分離培養(yǎng)物結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)：臨床分離結(jié)核桿菌純培養(yǎng)物結(jié)核抗體的檢測(cè)：血清IFN-γ釋放試驗(yàn)（T-SPOT.TB）：肝素鋰或肝素鈉抗凝血第14頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202415結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案標(biāo)本留取標(biāo)準(zhǔn)1.痰標(biāo)本：

（1）可疑肺結(jié)核患者：初診病人應(yīng)收集3份標(biāo)本（當(dāng)日即時(shí)、夜間和次日晨痰），治療中或隨訪病人應(yīng)按期留取2份痰標(biāo)本（晨痰、夜間痰），體積3～5ml，盛于廣口和具有螺旋蓋子的痰瓶中。（2）即時(shí)痰采集后立即送檢，夜間痰和晨痰采集后常溫保存不應(yīng)超過12小時(shí)，對(duì)當(dāng)日不能進(jìn)行涂片檢查的標(biāo)本，須置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。（3）對(duì)無(wú)法咳痰的患者：可使用高滲鹽水（3%NaCl）誘導(dǎo)痰或收集清晨胃液標(biāo)本，或使用支氣管鏡采集支氣管灌洗液標(biāo)本。第15頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202416結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案2．支氣管抽吸物、支氣管肺泡灌洗標(biāo)本、肺穿刺物、肺活檢標(biāo)本（1）對(duì)于不能留取痰標(biāo)本的患者：推薦使用侵入性采集技術(shù)獲取標(biāo)本，比如纖維支氣管鏡檢查、細(xì)針肺穿刺、肺活組織檢查。（2）嚴(yán)格器械清潔和消毒，避免引起交叉污染和感染。（3）支氣管鏡不能接觸自來(lái)水，通免污染環(huán)境分枝桿菌。

（4）對(duì)難以診斷的病例推薦使用其他侵入性技術(shù)采集標(biāo)本，比如細(xì)針穿刺、開放肺活組織檢查，無(wú)菌條件下采集的經(jīng)支氣管活檢和其他活檢標(biāo)本，運(yùn)輸過程中，應(yīng)加入0.5～1ml無(wú)菌的生理鹽水。（5）支氣管分泌物至少2～5ml；支氣管肺泡灌洗液至少20-50ml。第16頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202417結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案3.胃灌洗液（1）嬰幼兒、兒童和遲鈍者診斷肺結(jié)核時(shí)，鑒于無(wú)法采集標(biāo)本或支氣管灌洗液，推薦采集胃液標(biāo)本，通過胃灌洗咽下去的痰液。（2）標(biāo)本應(yīng)在采集4小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，否則應(yīng)置于一次性內(nèi)含100ml碳酸鈉酸他的無(wú)菌容器中。（3)胃灌洗液需連續(xù)采集3天，體積5～10ml，調(diào)節(jié)pH至中性。4.尿液（1）采集標(biāo)本前，應(yīng)清洗外生殖器，推薦連續(xù)采集3天清晨中段尿于無(wú)菌容器中，用于培養(yǎng)的尿液標(biāo)本至少需要40ml（2）只有在不能獲得中段尿時(shí)，可以使用導(dǎo)尿術(shù)采集標(biāo)本。（3）標(biāo)本運(yùn)送不及時(shí)，應(yīng)冷藏保存。第17頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202418結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案5.無(wú)菌采集的體液（腦脊液、胸水、腹水、心包積液、關(guān)節(jié)液、骨髓）（1）臨床醫(yī)生采用抽吸技術(shù)或外科操作無(wú)菌收集體液標(biāo)本于無(wú)菌容器。結(jié)核桿菌DNA及Xpert標(biāo)本：為防止標(biāo)本凝固，需加入EDTA抗凝處理（可注入于長(zhǎng)紫管中顛倒混勻抗凝處理）。IFN-γ釋放試驗(yàn)（T-SPOT.TB）標(biāo)本：分離淋巴細(xì)胞需加入肝素抗凝，抗凝比例為100ml胸腹水加入0.8ml肝素，顛倒混勻。（2）標(biāo)本盡可能快的運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室（3）應(yīng)提交足夠量的樣本，腦脊液＞5ml，胸水和腹水5～10ml。第18頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202419結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案6．無(wú)菌采集的組織（淋巴結(jié)、皮膚和其他活檢標(biāo)本）（1）采集標(biāo)本盡可能無(wú)菌操作，放置到無(wú)固定劑或防腐劑的無(wú)菌容器中，不能浸泡在鹽水或其他液體或用紗布包裹，重量不少于1g。應(yīng)迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸，為防止脫水可加入無(wú)菌鹽水，保持溫度在4～15℃（2）針對(duì)皮膚潰瘍，宜從病變組織周邊采集活檢標(biāo)本。（3）福爾馬林溶液浸泡過的標(biāo)本不能用于培養(yǎng)檢查。（4）極少量的活檢標(biāo)本可以浸泡在少量無(wú)菌鹽溶液中。第19頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202420結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案7.血液（1）如果血液標(biāo)本接種培養(yǎng)基之前需要運(yùn)輸，肝素成檸檬酸鹽可以用于抗凝。EDTA抗凝和凝固的血不能做培養(yǎng)。（2）血液和腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)推使且MYCO／FLYTIC瓶（BD）血培養(yǎng)瓶。（暫時(shí)不做）8.大便標(biāo)本大便標(biāo)本涂片的敏感性只有32％～34％，不能根據(jù)涂片的結(jié)果決定是否進(jìn)行培養(yǎng)。第20頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202421結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案9、病理組織切片（核酸檢測(cè)）在一只干凈的離心管中加入6-12片5-10μm厚的FFPE，勿切白片。

病理組織切片已固定，結(jié)核分枝桿菌已無(wú)活性，無(wú)法做培養(yǎng)。第21頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202422結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案DNA擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)有哪些不足相比DNA檢測(cè)技術(shù)，RNA檢測(cè)更適合判斷病原體轉(zhuǎn)錄活性，DNA檢測(cè)技術(shù)不能判斷病原體轉(zhuǎn)錄活性，不能區(qū)分潛伏感染和活動(dòng)性感染（活動(dòng)性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍，潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄）交叉污染問題變溫檢測(cè)，對(duì)儀器要求高抑制反應(yīng)（Taq酶）第22頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202423結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)教案免疫斑點(diǎn)干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)核菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)主要是細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)；T-SPOT.TB定量檢測(cè)人外周抗凝全血中受結(jié)核桿菌特異混合多肽抗原（ESAT-6和CFP-10）刺激分泌細(xì)胞因子干擾素的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量。結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白；所以的卡介苗菌株均丟失該基因序列絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)第23頁(yè)/共25頁(yè)5/9/202424結(jié)核分枝桿菌的核酸檢