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實(shí)驗(yàn)三小白鼠骨髓染色體制備及觀察1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求⑴掌握動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體制備技術(shù)⑵學(xué)會(huì)動(dòng)物細(xì)胞的滴片方法⑶觀察小白鼠染色體的形態(tài)特征和染色體數(shù)目2021/5/912、實(shí)驗(yàn)原理⑴小鼠骨髓細(xì)胞⑵秋水仙素可破壞骨髓細(xì)胞分裂過(guò)程中紡錘體的形成,把分裂細(xì)胞阻截在中期。⑶通過(guò)對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的低滲、固定、滴片、染色等處理,可觀察到小鼠染色體。⑷這種骨髓染色體制片方法簡(jiǎn)單,取材容易,不需無(wú)菌條件,方便易行。2021/5/923、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康小鼠(Musmusculus2n=40),體重約18~20g,雌雄不限。試劑甲醇、冰乙酸、石炭酸品紅、秋水仙素、KCl、生理鹽水2021/5/933、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)器材恒溫培養(yǎng)箱、普通離心機(jī)、顯微鏡、分析天平、離心管(5~10mL)、吸管注射器(5mL)、100mL燒杯、載玻片(冰片)2021/5/943、實(shí)驗(yàn)材料溶液配制:(1)0.01%秋水仙素:稱10mg秋水仙素,溶于100mL生理鹽水中。(2)低滲溶液:稱5.59克KCl溶于1,000mL蒸餾水中,其濃度為0.075M。2%檸檬酸鈉溶液::稱2.28克檸檬酸鈉溶于100ml蒸餾水中。Giemsa溶液2021/5/954、實(shí)驗(yàn)方法主要實(shí)驗(yàn)步驟⑴秋水仙素注射⑵解剖小鼠⑶離心⑷低滲⑸固定⑹制備細(xì)胞懸浮液⑺滴片⑻空氣干燥⑼染色⑽水洗⑾顯微鏡觀察結(jié)果2021/5/96方法與步驟取材前3~4h,向腹腔內(nèi)注射秋水仙素。注射濃度隨動(dòng)物種類不同而異。秋水仙素的主要作用是使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期,增加中期分裂相的比例。
2021/5/97腹腔內(nèi)注射秋水仙素3~4小時(shí)后,
斷頭處死小鼠。2021/5/98取出小鼠的后肢骨,注意不要將股骨剪斷,否則容易造成骨髓細(xì)胞的流失。2021/5/99滴加適量生理鹽水進(jìn)行沖洗,并仔細(xì)地將皮膚、肌肉等組織清除干凈。2021/5/910加入適量低滲液,用剪刀將骨充分剪碎,并用吸管吹打,使骨髓細(xì)胞全部釋放出來(lái)。亦可用注射器抽取檸檬酸銨溶液沖洗骨髓,效果佳2021/5/911將獲得的液體收集到離心管中,離心后去上清液,加低滲液至8ml左右,室溫下靜置20~30分鐘,進(jìn)行低滲。低滲結(jié)束后,加入1ml左右的Carnoy’s固定液進(jìn)行預(yù)固定,輕輕混勻后,離心。2021/5/9121000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,棄上清,加入固定液,混勻后,室溫放置25分鐘,再次離心去上清,重復(fù)固定一次,離心后,向沉淀中加入1ml固定液,將細(xì)胞重懸。2021/5/913預(yù)冷的玻片2021/5/914滴片后,將片子晾干,滴加適量Giemsa染液染色10~15分鐘,棄去染液,水洗,鏡檢。2021/5/915實(shí)驗(yàn)結(jié)果苯酚品紅染色效果2021/5/916結(jié)果顯示在顯微鏡尋找分散良好的中期分裂相。小白鼠染色體一般呈“U”形,都為近端著絲粒染色體。染色體數(shù)2n=40。圖示為吉姆薩染色效果2021/5/9175、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論繪制小鼠骨髓細(xì)胞染色體圖統(tǒng)計(jì)小鼠染色體數(shù)目如果有條件時(shí),要進(jìn)行顯微攝影,然后進(jìn)行組型分析2021/5/918
使用檸檬酸鈉的原因:在臨床上采取新鮮血液時(shí),需要加入一些消毒過(guò)的檸檬酸鈉,就能起到防止血液凝固的作用,所以檸檬酸鈉被稱為抗凝血?jiǎng)?。枸櫞酸根與血中鈣離子形成難解離的絡(luò)合物,鈣離子是凝血過(guò)程中所需的物質(zhì)之一,血液中鈣離子減少,而使血液凝固受阻。2021/5/919低滲的作用:低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液,例如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀(0.65M)、氯化鉀(0.075M)等。低滲效果取決于低滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時(shí)間。低滲處理是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展,同時(shí)可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開,以便能在一個(gè)平面上觀察所有染色體形態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中一般選用0.075MKCl為低滲液(具體情況取決于實(shí)際操作),其優(yōu)點(diǎn)有:①染色體輪廓清楚,可染色性強(qiáng),染色時(shí)間短,②用于顯帶染色時(shí)能充分顯示帶型特點(diǎn)。低滲處理為37℃,15-25分鐘,以預(yù)實(shí)驗(yàn)條件為準(zhǔn)。2021/5/920思考題1.KCl溶液低滲處理與滴片過(guò)程在
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