HYT 177-2014 海水中硫酸鹽還原菌的測(cè)定 MPN法

海水中硫酸鹽還原菌的測(cè)定MPN法Determinationofsulfate-reduci發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所、浙江國(guó)華浙能發(fā)電有限公司負(fù)責(zé)起草。1海水中硫酸鹽還原菌的測(cè)定MPN法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海水中硫酸鹽還原菌的MPN測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海水及海水利用濃海水中硫酸鹽還原菌的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T16310.1—1996船舶散裝運(yùn)輸液體化學(xué)品危害性評(píng)價(jià)規(guī)范水生生物急性毒性試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。硫酸鹽還原菌sulfate-reducing一類在無氧或缺氧狀態(tài)下，能將水中可溶性的硫酸鹽還原為硫化氫的細(xì)菌。應(yīng)用多管發(fā)酵技術(shù)，采用概率理論估算細(xì)菌濃度的方法。取自未污染海域，裝入玻璃瓶后儲(chǔ)放在暗處15d以上的海水。4方法原理本方法采用多管發(fā)酵技術(shù)，在(29±1)℃培養(yǎng)21d,如果試管底部產(chǎn)生黑色硫化鐵沉淀并伴有硫化氫臭味的，表明陽性反應(yīng)，采用MPN法對(duì)被測(cè)試樣中的硫酸鹽還原菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。5試劑與材料本試驗(yàn)方法中，除特殊規(guī)定外，應(yīng)使用分析純?cè)噭┖头螱B/T6682中三級(jí)水規(guī)格的水。試驗(yàn)所需試劑與材料如下：a)磷酸氫二鉀；b)無水氯化鈣；2e)硫酸鈉；f)酵母汁；h)硫酸亞鐵銨；i)半胱氨酸；k)陳海水；I)人工海水：按GB/T16310.1—1996配制；n)鹽酸溶液：1+11;o)牛皮紙，6儀器與設(shè)備6.1無菌箱(室)或超凈工作臺(tái)。6.2蒸汽壓力滅菌器。6.4電熱干燥箱：溫度控制范圍60℃~280℃,允差±2℃。6.5電熱恒溫水浴鍋：恒溫范圍37℃~100℃,允差±1℃。6.6天平：稱量范圍0g～220g,感量0.01g。6.8振蕩器。6.12燒杯：1000mL。6.13無菌試管：直徑18mm,長(zhǎng)度180mm,配硅膠塞。6.14無菌試管：直徑15mm,長(zhǎng)度150mm,配橡膠塞。6.15無菌刻度吸管或移液器和Tip頭。6.16無菌采樣瓶：廣口玻璃瓶或聚丙烯(PP)塑料瓶。7試驗(yàn)前準(zhǔn)備將水分裝在2個(gè)150mL磨口三角瓶(6.11)中，每瓶40mL,每個(gè)三角瓶塞子和瓶口間插入一小紙片來防止粘連，瓶口均用牛皮紙包扎，用蒸汽壓力滅菌器(121±1)℃滅菌20min,冷卻后備用。3成分如下(每升中的含量):a)磷酸氫二鉀b)無水氯化鈣c)氯化銨d)硫酸鎂e)硫酸鈉h)硫酸亞鐵銨i)半胱氨酸7.2.2.1將7.2.1a)～g)試劑溶解到500mL海水和500mL蒸餾水配制的混合水中，用氫氧化鈉溶液(160g/L)或鹽酸溶液(1+11)調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,并分裝于三角瓶(6.11)中，用蒸汽壓力滅菌器(121±1)℃滅菌20min,冷卻后備用。7.2.2.2硫酸亞鐵銨溶液：在培養(yǎng)基使用的當(dāng)天，稱取1.2g硫酸亞鐵銨，在無菌箱(室)(6.1)內(nèi)均勻地?cái)偡旁陔x紫外線燈的垂直距離30cm處滅菌30min,在無菌操作下，把硫酸亞鐵銨溶解于事先準(zhǔn)備好7.2.2.3半胱氨酸溶液：在培養(yǎng)基使用的當(dāng)天，稱取0.6g半胱氨酸，在無菌箱(室)(6.1)內(nèi)均勻地?cái)偡旁陔x紫外線燈的垂直距離30cm處滅菌30min。在無菌操作下，把半胱氨酸溶解于事先準(zhǔn)備好的7.2.2.4在無菌操作下，按每100mL培養(yǎng)基(7.2.2.1)分別加入1.0mL硫酸亞鐵銨溶液(7.2.2.2)和將陳海水或人工海水分裝在試管(6.13)中，每管9mL,用蒸汽壓力滅菌器(121±1)℃滅菌20min,將硫代硫酸鈉放在無菌箱(室)(6.1)內(nèi)，并均勻地?cái)偡旁陔x紫外線燈的垂直距離30cm處滅菌8分析檢測(cè)8.1.1用滅菌采樣瓶(6.16)采集被測(cè)樣品，在取樣過程中，要保護(hù)瓶口和頸部，防止這些部位受雜菌污8.1.2若采集的水中有余氯，或在不能判斷水中是否有余氯的情況下，應(yīng)在采樣前，在無菌操作下，于滅菌采樣瓶(6.16)中加入滅菌的硫代硫酸鈉(7.4),加入量為每升水樣約0.1g。若確定水樣不含余氯，4則無需加入硫代硫酸鈉(7.4)。8.1.3水樣采集后，應(yīng)立即進(jìn)行測(cè)定，如果在2h內(nèi)不能進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)把水樣放在冰箱中冷藏保存，存放時(shí)間不宜超過24h。經(jīng)冷藏保存后的水樣需測(cè)定時(shí)，從冰箱中取出，在生化培養(yǎng)箱(6.3)中(29±1)℃活化4h～5h,再進(jìn)行測(cè)定。8.2水樣的稀釋和接種8.2.1按10倍稀釋法對(duì)水樣進(jìn)行系列稀釋，應(yīng)使最后一個(gè)稀釋度接種培養(yǎng)后無硫酸鹽還原菌生長(zhǎng)。8.2.2將不同稀釋度的水樣分別接種到無菌試管(6.14)中，每個(gè)稀釋度重復(fù)接種3～5管，每管接種1mL,每接種一個(gè)稀釋度更換一支無菌吸管或Tip頭(6.15)。測(cè)定一個(gè)水樣從接種到灌入培養(yǎng)基不得超過20min。8.2.3另取一組無菌試管(6.14),接種1mL無菌稀釋水作為空白對(duì)照。8.2.4將無菌培養(yǎng)基放入電熱恒溫水浴鍋(6.5)中，加熱至60℃,取出冷卻至室溫后灌滿試管(8.2.2和8.2.3),蓋上密封膠塞。在生化培養(yǎng)箱(6.3)中，于(29±1)℃培養(yǎng)21d。9計(jì)數(shù)與報(bào)告9.1如果試管中產(chǎn)生黑色沉淀并伴有硫化氫臭味的表示有硫酸鹽還原菌存在，以“+”(陽性)表示，否9.2如果空白對(duì)照出現(xiàn)陽性反應(yīng)，表明測(cè)定過程中有污染，本次測(cè)定無效。9.3數(shù)出10進(jìn)位稀釋管中陽性試管數(shù)，以陽性組合指數(shù)記錄下來。9.4在10進(jìn)位稀釋中多于三個(gè)稀釋度時(shí)，陽性組合的指數(shù)只需要用其中依次的三個(gè)稀釋度，以每個(gè)稀釋度接種5管為例，對(duì)這三個(gè)稀釋度的決定是先選5管全部陽性反應(yīng)的最大稀釋度，然后選出與其相連的兩個(gè)更高的稀釋度，算出陽性組合指數(shù)(見表1例1、例2、例4)。9.5若按照9.4所規(guī)定的原則選出三個(gè)稀釋度后，有更高的稀釋度仍然產(chǎn)生一個(gè)陽性試管時(shí)，就應(yīng)該將這一個(gè)陽性試管并入所選擇的最高稀釋度的陽性結(jié)果中(見表1例3)。9.6根據(jù)陽性組合的指數(shù)，查附錄A得出最大可能菌數(shù)，除以陽性組合指數(shù)的第一位數(shù)字的稀釋度數(shù)，即為每毫升水樣中硫酸鹽還原菌的菌數(shù)(如果每個(gè)稀釋度重復(fù)接種4管或3管，根據(jù)陽性組合的指數(shù)查附錄B或附錄C)。9.7報(bào)告方式見表1。表1計(jì)數(shù)與報(bào)告方式陽性組(個(gè)/mL)1552002542005表1(續(xù))陽性組(個(gè)/mL)3十—一3110455506(規(guī)范性附錄)五個(gè)平