生物醫(yī)學工程前沿之生物醫(yī)學檢測與疾病診斷

《生物醫(yī)學工程前沿》主講教師涂秋芬第二章生物醫(yī)學檢測與疾病診斷一：顯微鏡的發(fā)展二：醫(yī)學生物化學檢測三：醫(yī)學成像檢測一：顯微鏡的發(fā)展（一）光學顯微鏡的鼻祖---單式顯微鏡早在公元前一世紀，人們就已發(fā)現通過球形透明物體去觀察微小物體時，可以使其放大成像。后來逐漸對球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認識。單式顯微鏡的致命缺點：它的焦距與透鏡直徑成正比,與放大倍數成反比。如果放大倍數是100倍,透鏡的焦距為0.25毫米,透鏡直徑大約為0.33毫米。他一生親自磨制了550個透鏡，裝配了247架顯微鏡，為人類創(chuàng)造了一批寶貴的財富，至今保留下來的有9架。

（二）列文虎克顯微鏡——單式顯微鏡的頂峰

用列文虎克制作的顯微鏡觀察到的人血涂片

現存于荷蘭尤特萊克特大學博物館(UniversityMuseumofUtrecht)中的一架的放大倍數為270倍。分辨力為1.4μm。在當時,這個水平是很高的，直到19世紀初所制的顯微鏡還未超過這一水平。

大約在16世紀末，荷蘭的眼鏡商詹森（ZacchariasJanssen）和他的兒子把幾塊鏡片放進了一個圓筒中，結果發(fā)現通過圓筒看到附近的物體出奇的大，這就是現在的顯微鏡和望遠鏡的前身。

詹森制造的是第一臺復合式顯微鏡。其基本原理是使用兩個凸透鏡，一個凸透鏡把另外一個所成的像進一步放大。（三）最早的復式顯微鏡

第一個復式顯微鏡——詹森顯微鏡復式顯微鏡的發(fā)明,是科學史上的里程碑,人類從此開始認識微觀世界。從十六世紀晚期，第一個復式顯微鏡發(fā)明并開始被人們使用，一直到十七世紀末,復式顯微鏡都使用得沒有單式顯微鏡廣泛。因為當時的透鏡制造技術不高,制造出的復式顯微鏡的像差和色差都很大，這使人們大都不喜歡使用復式顯微鏡。不過還是有些人制造,使用了一些復式顯微鏡，例如意大利人伽利略(Galileo)和英國人羅伯特.胡克(Hooke)。

伽利略的顯微鏡胡克的顯微鏡軟木塞（四）卡夫顯微鏡（十八世紀）英國顯微鏡設計師JohnCuff在17世紀中葉設計了一種新型的顯微鏡。這種顯微鏡很快得到了人們的喜愛。在以后的很多年里這種顯微鏡被大量地制造和使用(甚至在當時的一些解剖學著作里都可以看到對這種顯微鏡的介紹)，同時又被不斷地改造和完善。它們被統(tǒng)稱為Cuff顯微鏡。這類顯微鏡的特色在于:

新式底座：幾乎所有的顯微鏡的基座都連在一個木盒子上。

獨特鏡臂結構。

當時最先進的聚光方法。

卡夫(Cuff)顯微鏡

十九世紀，隨著工業(yè)革命的進行，顯微科學也同其它學科一起飛速發(fā)展起來。其主要的原因是機械的使用使透鏡的質量大大提高和光學的發(fā)展使顯微鏡的結構更加符合光學原理。（五）Wenham顯微鏡（十九世紀）

由FrancisWenham在1882年制造。有著當時最為精巧先進的齒輪傳動系統(tǒng)和齒輪調焦系統(tǒng),聚光系統(tǒng)，還有成像系統(tǒng)

。是十九世紀中性能最好的顯微鏡,也是歷史上最精美的顯微鏡?！捎谌藗冊谖锢?，數學和材料科學等領域取得了非常大的進展，顯微鏡的質量大大提高。※數字成像技術開始了用計算機來處理傳送顯微影象的時代，使人們記錄顯微影象的方式又前進了一步。（六）現代顯微鏡（二十世紀以后）倒置相差顯微鏡蔡司普通光學顯微鏡熒光顯微鏡※激發(fā)光源（紫外光或藍紫光）激發(fā)標本（經過熒光染色或沒有）產生熒光進行觀察?！鶅?yōu)點：成像對比強烈，色彩鮮艷，分辨率高，可以觀察到一般不可見的物質（如DNA等分子）的分布情況等?！忻饕曇?、暗視野

※相差

※偏振、微分干涉

※熒光

※顯微攝影

是一種高檔次的顯微鏡。萬能顯微鏡細胞光學顯微鏡圖片CD31人類認識生物的腳步絕對不會停止在細胞水平，對于亞細胞物質、微小病毒顆粒的認識需要更大放大倍數的顯微鏡出現。SARS病毒

示意圖血小板

西門子公司于1939年研制成功世界上第一臺商品透射電鏡，分辨率優(yōu)于100埃；1954年進一步研制成功ElmiskopI型透射電鏡，分辨率優(yōu)于10埃。

德國西門子公司總部15（七）透射電子顯微鏡隨著20世紀90年代納米科技的發(fā)展，有力推動了透射電鏡的進一步發(fā)展，目前透射電鏡晶格分辨率最高達0.1nm，放大倍率150萬倍。加速電壓可達2000kv的超高壓透射電鏡17核仁清晰、細胞器豐富透射電鏡（×6656）SARS病毒透射電鏡圖比較部分光學顯微鏡透射電鏡光源可見光(日光、電燈光)電子源(電子槍)照明控制玻璃聚光鏡電子聚光鏡樣本1mm厚的載玻片約10nm厚的薄膜放大成象系統(tǒng)玻璃透鏡電子透鏡介質空氣和玻璃高度真空聚焦方法移動透鏡改變線圈電流或電壓分辨本領200nm0.2~0.3nm有效放大倍數103×106×在透射電鏡的基礎上,1935年德國學者諾爾首次提出了掃描電鏡的概念，1952年劍橋大學Oatley等制作了第一臺掃描電鏡。OatleyandMcMullan

18（八）掃描電子顯微鏡1965年劍橋大學推出第一臺商品掃描電鏡。目前其發(fā)展方向是場發(fā)射型高分辨掃描電鏡和環(huán)境掃描電鏡。場發(fā)射掃描電鏡（左）和環(huán)境掃描電鏡（右）目前掃描電鏡的最高分辨率可達1-2nm，最好的高分辨環(huán)境掃描電鏡可在氣壓為4000Pa下仍保持2nm的高分辨率水平。掃描電鏡下的花粉圖片20能譜的測試范圍有限，一般為Be（4）到U（92），在這范圍之外元素的信號不能通過探測窗口。1：EDS所能測到的是核外原子數必須大于2的，所以H、He都是測不到的。2：核外電子太少

采集器采集時只能采到很少。掃描電鏡分析材料元素

史上最強顯微鏡----掃描透射電子全息顯微鏡（STEHM）日本日立公司用了一年時間在加維多利亞大學一個研究中心地下實驗室，組裝了這部超高分辨率、超穩(wěn)定的儀器。2013-07-31重7噸、高4.5米；分辨率35皮米（0.035nm）；該顯微鏡能讓研究人員以一種前所未有的方式觀測原子、確定元素類型和數量。有了這部設備，很多需要觀測原子結構量級的國際多學科科學和工程研究項目得以深入開展，相關科學研究也將開啟新紀元。（九）激光共聚焦顯微鏡1957年，MalwinMinsky在其專利中首次闡明了激光共聚焦顯微鏡技術的基本工作原理，1970年，Sheppard和Wilson推出第一臺單光束共聚集激光掃描顯微鏡，1987年，White和Amos在Nature雜志發(fā)表了“Confocalmicroscopycomeofage”,標志著LSCM已成為科學研究的重要工具。激光共聚焦顯微鏡結構圖激光掃描共焦顯微鏡基本原理激光掃描共焦顯微鏡分辨率人眼分辨率： 0.2mm光學顯微鏡分辨率：0.25μm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18μm共焦顯微鏡與傳統(tǒng)熒光顯微鏡的區(qū)別（1）

抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像。（3）

點對點掃描去除了雜散光的影響。（2）

具有更高的軸向分辨率，

并可獲取連續(xù)光學切片。（十）原子力顯微鏡1981年，IBM公司蘇黎士研究所的科學家成功開發(fā)掃描隧道顯微鏡，為原子力顯微鏡的問世奠定了基礎。1986年，徳裔物理學家G.Binnig等人原子力顯微鏡進行了改良，開始使用微懸臂梁作為探針。1988年，國外開始對原子力顯微鏡進行改進，激光檢測原子力顯微鏡。1989年，白春禮等人研制出了我國第一臺原子力顯微鏡，并躋身于國際先進行列。原子力顯微鏡發(fā)展歷史原子力顯微鏡工作原理金屬表面與針尖的電子云圖圖AFM的工作原理將一個對微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸，由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力，通過在掃描時控制這種力的恒定，帶有針尖的微懸臂將對應于針尖與樣品表面原子間作用力的等位面而在垂直于樣品的表面方向起伏運動。利用光學檢測法或隧道電流檢測法，可測得微懸臂對應于掃描各點的位置變化，從而可以獲得樣品表面形貌的信息。原子力顯微鏡的成像特點具有非常高的橫向分辨率和縱向分辨率。橫向分辨率可達到0.15nm，縱向分辨率高達0.05nm。原子力顯微鏡具有很寬的工作范圍，可以在諸如真空、空氣、高溫、常溫、低溫以及液體環(huán)境下掃描成像。樣品制備簡單。原子力顯微鏡所觀察的標本不需要包埋、覆蓋、染色等處理，可以直接觀察。原子力顯微鏡具有對樣品的分子或原子進行加工的力行為。（1）小尺寸樣品的觀察：

適用于觀察原子級樣品，DNA分子等，在納米材料科學、分子生物學、仿生學等研究領域有廣泛研究。原子力顯微鏡對表面形貌的觀測原子力顯微鏡的應用沉積于云母片上的抗體分子原子力顯微鏡，使得學鍵首次肉眼可見（5月30日《Science》）（2）納米加工：

利用AFM可以對樣品進行表面原子搬運，原子蝕刻，從而制造納米器件。用AFM針尖移動Si原子形成的IBM文字STM針尖移動原子形成的圖形文字（3）測量腫瘤細胞、微生物等的粘附力

（4）測量分子間的作用力，例如抗原抗體結合力、受體配體結合力

（5）DNA互補鏈間的氫鍵

二：醫(yī)學生物化學檢驗（一）醫(yī)學生物化學檢驗（臨床檢驗）醫(yī)學生物化學檢驗是以健康和疾病發(fā)生時的生物化學過程為研究目的，通過測定組織、體液的成分，揭示疾病變化和藥物治療對機體生物化學過程和組織、體液成分的影響，以提供疾病診斷、病情監(jiān)測、藥物療效、預后判斷和疾病預防有用信息的一門學科。病理生理學免疫學藥理學實驗診斷學檢驗學生理學生物化學著名的諾貝爾獎獲得者亞瑟·肯伯格在哈佛大學醫(yī)學院建校100周年時說：“所有的有生命體都有一個共同的語言，這個語言就是化學?！鄙谋举|是化學自然界所有的生命物體都由三類物質組成：水、無機離子和生物分子。生物分子是生物體和生命現象的結構基礎和功能基礎，是生物化學研究的基本對象?！?780-1789Lavoisier（法）研究“生物體內的燃燒”，指出此類“燃燒”耗氧并排出二氧化碳。后人稱他是生物化學之父。（二）生物化學發(fā)展里程碑Lavoisier（拉瓦錫）◆1830-1842Liebig（德）將食物分為糖、脂、蛋白質類，提出“代謝”一詞，證明動物體溫形成是食物在體內“燃燒”的緣故。最先寫出兩本生物化學相關專著。Liebig（李比希）EmilFischer（埃米爾·費舍爾）◆1890－1902Fischer（德）首次證明了蛋白質是多肽；發(fā)現酶的專一性，提出并驗證了酶催化作用的“鎖-匙”學說；合成了糖及嘌呤。1902年獲諾貝爾獎。李納斯·鮑林（LinusPauling）◆1949Pauling（美）指出鐮刀形紅細胞性貧血是一種分子病，并于1951年提出蛋白質存在二級結構。（1954年獲諾貝爾獎）詹姆斯·沃森（JamesD.Watson）◆1953年Watson（美）與Crick（英）提出DNA分子的雙螺旋結構模型，1962年共獲諾貝爾獎。弗朗西斯·克里克（FrancisH.Crick）弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）

◆諾貝爾化學獎(1958年)1955年將胰島素的氨基酸序列完整地定序出來，同時證明蛋白質具有明確構造。

◆諾貝爾化學獎(1980年)

1975年，Sanger雙脫氧鏈終止法（chainterminationmethod）技術測定DNA序列。1969-1972,Arber(瑞士),Smith(美)與Nathans(美)在核酸限制酶的分離與應用方面做出突出貢獻,1978年共獲諾貝爾獎。1972Berg（美）在基因工程基礎研究方面作出了杰出成果，獲1980年諾貝爾獎。1973Cohen等（美）用核酸限制性內切酶EcoR1，首次基因重組成功。HamiltonO.SmithDanielNathansWernerArberPaulBergStanleyCohenHerbertBoyer2001Venter（美）等報道完成了人類基因組草圖測序。早在3000年前就有人發(fā)現了疾病可引起體液成分的變化。最早注意到的是尿液中的蛋白和糖。18世紀后期，英國醫(yī)生BenceJones提出了第一個腫瘤標志物。100多年前，有人使用重量分析法對血漿電解質進行分析。直到50年代初，火焰光度計的使用才使電解質的分析方法產生了革命性的變化。1920年開始了對體液酶的分析。70年代，放射免疫分析。初

期（三）生物化學發(fā)展的趨勢71各種計算機系統(tǒng)控制的全自動生化分析儀以及各種商品化藥盒在我國臨床實驗室廣泛應用。21世紀引進生化分析儀的模塊化系統(tǒng)，使得生化檢驗系統(tǒng)概念形成。

氣相和高效液相色譜分析使人們能更有效地進行治療藥物的監(jiān)測，并對體內激素和代謝物水平和成分實施分析。近期：72質譜分析則提供了藥物和新生兒代謝異常迅速鑒定的手段。

生物芯片儀器設備的實質是對生物信號進行平行分析：利用微點陣技術，將細胞、蛋白質以及DNA等生物組份在小范圍固相基質上進行集中，從而在空間盡量縮小但速度盡量加快的情況下完成傳統(tǒng)生物學分析手段。全實驗室自動化：把實驗室相關或不相關的自動化儀器通過計算機整合系統(tǒng)串聯整合，形成自動化的大規(guī)模檢驗過程，使檢測作業(yè)平臺為流水線組合。發(fā)展趨勢：1：樣品盤或樣品架樣品盤：放置待測樣品的轉盤，可放置一定數量的樣品杯或不同規(guī)格的采血試管，通過樣品盤的轉動來控制不同樣品的進樣。樣品架：隨著樣品架移動及樣品的被檢測，可不斷追加已放置樣品杯或采血試管的樣品架；通過樣品架的移動能將樣品傳送到另一個分析模塊甚至另一臺分析儀上再進行分析。全自動生化分析儀基本結構

轉盤式試劑室：內裝放置試劑瓶的轉盤，一般可放置20種以上具有一定形狀的塑料試劑瓶，大型分析儀可放置30-45種試劑瓶。通過試劑轉盤的轉動來選用不同試劑。

2：試劑室和試劑瓶試劑架式試劑室：可放置容量為250ml-500ml的任意形狀的試劑瓶，試劑瓶不能轉動，但每個試劑瓶內引出一條試劑管路及其噴嘴，即每種試劑均有專用的加試劑裝置，因而不同試劑間無交叉污染。

但試劑管路較長使試劑存在一定的死體積，因而適宜用于使用頻率高、消耗試劑量大的檢測項目。3：反應杯和反應盤是樣品與試劑進行化學反應的場所，同時用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光徑不同分析儀有0.5-0.7厘米不等，大多數分析儀在計算時將其折算為1厘米光徑。由取樣針、取樣臂、取樣管路、取樣注射器和閥門組成，能定量吸取樣品或試劑并加入到反應杯（盤）。

4：取樣和加試劑裝置多數加樣裝置設有防撞功能，遇到阻礙時取樣針立即停止運動并報警。某些取樣針還設有阻塞報警功能，當取樣針被樣品中的凝塊、纖維蛋白等物質阻塞時，機器會自動報警、沖洗取樣針，并跳過當前樣品，進行下一個樣品的取樣檢測。78

反應杯里的樣品與試劑通過攪拌棒攪拌而充分混勻，攪拌棒的形狀為扁平棒狀或扁平螺旋狀，表面的疏水材料能防止反應液被攪拌棒所攜帶。其工作方式大多為旋轉式攪拌，也有震動式攪拌方式。5：混勻與攪拌裝置79溫控系統(tǒng)使反應杯浸浴在恒溫環(huán)境：恒溫循環(huán)水浴方式：溫度傳遞速度快，保養(yǎng)要求較高。恒溫空氣浴方式：溫度傳遞速度不如恒溫水浴循環(huán)方式，保養(yǎng)簡單。

6：溫控和定時系統(tǒng)80自動生化分析儀以紫外可見分光光度法為其中心和主要的檢測手段，與一般分光光度計一樣，其光路和檢測系統(tǒng)由光源、單色器和檢測器組成。7：光路和檢測系統(tǒng)光源：一般為鹵素鎢絲燈，也有采用長壽命的氙燈。要求在340～800nm波長范圍內能發(fā)射出穩(wěn)定且較平坦的光能。單色器：干涉濾光片（interferencefilter）分光系統(tǒng)：常帶有340、380、405、500、550、600、660nm等幾種濾光片，各濾光片固定在轉盤上，以轉盤旋轉的方式來選擇波長。檢測器：由光敏二極管及放大電路組成，可按設定的間隔時間連續(xù)測定各反應杯的吸光度值。81具有多種數據處理功能：計算測定結果判斷結果準確性保存各種數據自我診斷功能

8：數據處理系統(tǒng)82

反應杯清洗裝置：一個反應杯內的反應和檢測結束后，該反應杯就被沖洗系統(tǒng)及時沖洗。清洗過程：由廢液針吸取反應杯內廢液，加入清洗劑沖洗并抽干后，再經數次去離子水沖洗及抽干，然后做杯空白的吸光度檢查，若通過檢查則此反應杯可繼續(xù)循環(huán)使用；更高級的儀器帶有風干技術。如果不能通過，分析儀將提示該反應杯異常，并跳過此反應杯使用下一個反應杯，或提示更換反應杯。9：清洗系統(tǒng)三：醫(yī)學成像檢測

醫(yī)學成像技術是借助于某種介質（如X線、電磁場、超聲波，放射性核素等）與人體相互作用，用理工學基礎理論和技術，把人體內部組織器官的結構、功能等具有醫(yī)療情報的信息源傳遞給影像信息接收器，最終以影像的方式表現出來，提供給診斷醫(yī)生，使醫(yī)生能根據自己的知識和經驗對醫(yī)學影像中所提供的信息進行判斷，從而對病人的健康狀況進行判斷的一門科學技術。

從1895年德國物理學家倫琴發(fā)現X光并由此拍出世界上第一張倫琴夫人手部的X線透視照片以來，醫(yī)學影像技術從無到有、從不完善到功能齊全、分類精細，經歷了一個１0０多年的發(fā)展過程。（一）醫(yī)學影像技術發(fā)展歷程1、1895年11月8日，德國物理學家倫琴在做真空管、高壓、放電實驗時，發(fā)現了X射線，并用于臨床的骨折和體內異物的診斷。

※

1896年，德國西門子公司研制出世界上第一支X線球管。

※20世紀10-20年代，出現了常規(guī)X線機。

※20世紀60年代中、末期形成了較完整的放射診斷或放射學學科體系。第一張X線照片倫琴2、1971年，世界上第一臺用于顱腦的CT掃描機（計算機人體斷層攝影術）由柯馬克(A.M.Cormack)和郝恩斯費爾(G.N.Hounsfield)首次研制成功。1979年因此項技術的發(fā)明，柯馬克、郝恩斯費爾獲得了生理與醫(yī)學諾貝爾獎。世界上第一臺4層CT掃描機豪恩斯費爾德

CT機的分代主要以其Ｘ線管和探測器的關系、探測器的數目、排列方式以及Ｘ線管與探測器的運動方式來劃分。到今天為止CT經歷了5代發(fā)展，第6代CT正在研發(fā)中。（1）第1代CT機只有一個探測器，掃描角度為1o，掃描時間270s/層。僅用頭部的掃描,圖像質量差,以平移加旋轉的掃描運動方式進行,稱為平移/旋轉型。（2）第2代CT機探測器的數目增加5～20個左右，X線束呈扇型，掃描角度增加為360o,掃描時間仍較長,一般在20s～1min/層，掃描方式為窄扇形束掃描平移-旋轉方式。（3）第3代CT探測器數目一般多超過100個，有的接近1000個，X線扇形束擴大到40o～50o，足以覆蓋人體的橫徑,這樣掃描就不需要再平移，而只需要旋轉就可以了,故稱為旋轉/旋轉型。掃描時間一般均在幾秒鐘,最快速度0.5s，實現了亞秒級掃描。（4）第1代到第3代CT機的X線管和探測器都是同步旋轉的，而第4代CT機與之不同，探測器呈360o環(huán)狀固定排列在機架內(目前有的機型多達4800個探測器)，X線則圍繞人體和機架作360o旋轉,把第4代稱固定/旋轉型(螺旋CT屬此型)。（5）第5代CT機與第1到第4代CT機不同，在成像過程中X線管不需環(huán)繞機架作機械運動，它是用電子束方法產生旋轉的X線源,再穿透人體由探測器接收,這種CT機稱為電子束CT,也稱超高速CT，特點是掃描速度很快,50～100