任務(wù)三 紫外-可見分光光度計的使用

《儀器分析》——茶與食品科技學(xué)院任務(wù)二紫外-可見分光光度法掌握紫外吸收光譜分析法的基本原理以及定量分析方法掌握分光光度計主要組成部分的結(jié)構(gòu)和作用了解紫外分析條件的選擇、干擾的抑制以及適用范圍學(xué)習(xí)目標(biāo)一、原理(一)光的基本特性(二)物質(zhì)對光的選擇性吸收(三)吸收定律（一）光的基本特性為什么溶液呈現(xiàn)不同的顏色？CuSO4溶液高錳酸鉀溶液？一（一）光的基本特性1、電磁波譜光是一種電磁波，具有波粒二重性。光既是一種波，具有波長（

）；光也是一種粒子，又具有能量（E）。2、單色光和互補光單色光：具有同一種波長的光。復(fù)合光：含有多種波長的光。如：白光?；パa光：如果把適當(dāng)顏色的兩種光按一定的強度比例混合，可成為白光，那么兩種顏色的光稱為互補光。（一）光的基本特性

/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠1、物質(zhì)顏色的產(chǎn)生完全吸收完全透過吸收黃色光復(fù)合光（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收1、物質(zhì)顏色的產(chǎn)生結(jié)論：若某溶液選擇性地吸收了可見光區(qū)某波長的光，則該溶液呈現(xiàn)出被吸收光的互補色光的顏色。（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收1、物質(zhì)顏色的產(chǎn)生如：重鉻酸鉀溶液顏色是黃色的，溶液吸收了可見光中的？色；硫酸銅溶液顏色是藍(lán)色的，溶液吸收了可見光中的？色

。藍(lán)色黃色2、物質(zhì)的吸收光譜曲線將某物質(zhì)的溶液，用不同波長的單色光作入射光，測定這一溶液吸光度A。每種波長的單色光都有其相對應(yīng)的吸光度。然后以A為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)作圖，所得曲線即為該溶液的吸收光譜。吸收光譜中與吸收峰相對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長，

max

max=515

A480520560nm（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收2、物質(zhì)的吸收光譜曲線（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收1、2、3、4為B物質(zhì)的四種濃度吸收曲線→不同濃度的高錳酸鉀溶液，其吸收曲線形狀相似，最大波長不變。A、B、C三種物質(zhì)吸收曲線→不同物質(zhì)的吸收曲線，其形狀和最大吸收波長都各不相同2、物質(zhì)的吸收光譜曲線（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收吸收曲線的形狀和

max是定性分析的基礎(chǔ)溶液的濃度愈大吸光度愈大是定量分析的基礎(chǔ)（二）物質(zhì)對光的選擇性吸收3、吸收光譜產(chǎn)生的機理分子中電子躍遷產(chǎn)生的電子光譜處于紫外和可見光區(qū)。電子躍遷的同時，伴隨著振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷：帶狀光譜。

1、透光率與吸光度（三）吸收定律透射光的強度It與入射光的強度I0的比值稱為透光率被測溶液和參比溶液分別置于同樣質(zhì)地和厚度的比色皿中，反射光強度大小近似可相互抵消(以參比溶液校正)，則上式簡化為I0=Ia+It透光率愈大，溶液對光的吸收愈少I0=Ia+It+IrI0ItIrIa1、透光率與吸光度（三）吸收定律I0=Ia+It+IrI0ItIrIa透光率的負(fù)對數(shù)稱為吸光度A(absorbance)吸光度愈大，溶液對光的吸收愈多2、朗伯-比爾定律1760年，Lambert從實驗中找到了A與液層厚度的關(guān)系式：A=k1b

k1為與被測物性質(zhì)、入射光波長、溶劑、溶液濃度和溫度有關(guān)的常數(shù)當(dāng)入射光波長、溶劑和吸光物質(zhì)種類、濃度和溶液的溫度都一定時，該溶液的吸光度只與液層厚度成正比（三）吸收定律2、朗伯-比爾定律（三）吸收定律1852年，Beer從實驗中找到了A與溶液濃度的關(guān)系式：A=k2c

k2為與被測物性質(zhì)、入射光波長、溶劑、液層厚度和溫度有關(guān)的常數(shù)當(dāng)入射光波長、溶劑和吸光物質(zhì)種類、液層厚度和溶液的溫度都一定時，該溶液的吸光度只與溶液濃度成正比（三）吸收定律2、朗伯-比爾定律合并這兩個式子，得到入射光被溶液吸收的程度與溶液的厚度關(guān)系為：朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光垂直入射通過均勻、透明的吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液對光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。

A=Kbc（三）吸收定律2、朗伯-比爾定律(1)適用條件：必須使用單色光；吸收發(fā)生在均勻的介質(zhì)；（溶液為稀溶液）吸收過程中，吸收物質(zhì)互相不發(fā)生作用；吸收定律對紫外光、可見光、紅外光都適用。（三）吸收定律2、朗伯-比爾定律(2)吸光系數(shù)K物理意義：單位濃度的溶液液層厚度為1cm時，在一定波長下測得的吸光度。K大小與入射波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)有關(guān)。摩爾吸光系數(shù):當(dāng)溶液濃度c的單位為mol/L，用ε表示，其單位為L/mol·cm。質(zhì)量吸光系數(shù):當(dāng)溶液濃度c的單位為g/L，用a表示，其單位為L/g·cm。（三）吸收定律3、吸光度的加和性

在多組分的體系中，在某一波長下，如果各種對光有吸收的物質(zhì)之間沒有相互作用，則體系在該波長的總吸光度等于各組分吸光度的和。A總=A1+A2+…An=ΣAn（三）吸收定律4、影響吸收定律的主要因素（1）入射光為非單色光引起偏離（2）溶液的化學(xué)因素引起偏離（3）比爾定律的局限性引起偏離AC比爾定律只適用于濃度小于0.01mol?L－1的稀溶液二、儀器(一)基本組成部件(二)類型及特點（一）儀器的基本組成部件光源碘鎢燈氘燈單色器吸收池參比池樣品池檢測器數(shù)據(jù)處理和儀器控制（一）儀器的基本組成部件光源單色器吸收池檢測器顯示動畫（一）儀器的基本組成部件1、光源*作用：供給符合要求的入射光。（1）可見光光源可見光光源：鎢絲燈和鹵鎢燈。發(fā)射波長范圍為325～2500nm。（2）紫外光光源光源：氫燈和氘燈。發(fā)射185～375nm。為了使光源發(fā)出的光在測量時穩(wěn)定，光源的供電一般都要用穩(wěn)壓電源，即加有一個穩(wěn)壓器。（一）儀器的基本組成部件2、單色器*作用：把光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解成單色光，并能準(zhǔn)確方便地“取出”所需要的某一波長的光，它是分光光度計的心臟部分。組成：單色器一般由狹縫、色散元件（棱鏡和光柵）、透鏡系統(tǒng)組成。（一）儀器的基本組成部件（1）棱鏡單色器玻璃棱鏡：可吸收紫外光，只能用于可見光區(qū)域。石英棱鏡：用于紫外、可見和近紅外三個光區(qū)域。（2）光柵單色器可用于紫外、可見及紅外光區(qū)域，目前生產(chǎn)的紫外-可見分光光度計大多采用光柵作為色散元件。（一）儀器的基本組成部件3、吸收池（比色皿）*作用：用于盛放待測液和決定透光液層厚度的器件。*吸收池的規(guī)格是以光程為標(biāo)志。吸收池規(guī)格：0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm、5.cm等。（一）儀器的基本組成部件

比色皿的正確選擇*玻璃比色皿：只能用于可見光光區(qū)測定。應(yīng)用波長范圍350-1000nm。石英比色皿：用于紫外光區(qū)測定，也可以用于可見光光區(qū)測定。應(yīng)用波長范圍190-350nm。（一）儀器的基本組成部件4、檢測器（接受器）

*作用：對透過吸收池的光做出響應(yīng)，并把它轉(zhuǎn)變成電信號輸出，其信號大小與透過光的強度成正比。常用的檢測器：光電池、光電管和光電倍增管。5、信號顯示器*作用：由檢測器產(chǎn)生的電信號，經(jīng)放大等處理后，用一定方式顯示出來，以便于計算和記錄。常用的信號顯示器：（1）指示儀表（檢流計或微安表），（2）數(shù)字顯示和自動記錄型裝置。（二）分光光度計的類型及特點紫外分光光度計：使用波長范圍是200～400nm可見分光光度計：使用波長范圍是400～800nm（二）分光光度計的類型及特點（二）分光光度計的類型及特點單光束分光光度計是指從光源發(fā)出的光，經(jīng)過單色器等一系列光學(xué)元件及吸收池后，最后照在檢測器上始終為一束光。雙光束分光光度計是指從光源發(fā)出的光，經(jīng)過單色器后被切光器分為強度相等的兩束光，分別通過參比溶液和樣品溶液，利用切光器使兩束光交替地照在同一檢測器上。（二）分光光度計的類型及特點雙波長分光光度計是由同一光源發(fā)出的光被分成兩束光，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值。三、使用與維護1、分光光度計操作步驟*1）預(yù)熱儀器。接通電源，檢查無擋光物，打開電源（自檢狀態(tài)），預(yù)熱20min（工作狀態(tài)）。2）選擇合適光源。200～370nm選用氘燈，370～800nm選用鎢絲燈。3）選擇測試模式。用“模式”鍵設(shè)置測試方式，根據(jù)需要選擇吸光度（A）、濃度（c）、透射比（T）。4）選擇分析波長。三、使用與維護5）放入樣品溶液。將參比溶液（放第一格）和待測溶液（放其它格內(nèi)）放入樣品槽中，蓋上樣品室蓋。6）調(diào)零，0A/100%T。將參比溶液推入光路。按【0ABS/100%T】鍵，顯示屏顯示為A=0.000/T=100%。調(diào)0%T。打開樣品室蓋，按【0%T】鍵，顯示屏顯示為－0.XXXA。7）測定。將待測溶液推入光路，依次測試待測溶液數(shù)據(jù)，記錄。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。8）關(guān)機。測量完畢，取出吸收池，清洗并倒置在吸水紙上晾干，晾干后入盒保存，切斷電源。整理桌面，罩上儀器防塵罩，填寫儀器使用記錄。三、使用與維護2、分光光度計注意事項*1）為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。2）比色皿的使用方法：①拿取比色皿時，只能用手指接觸兩側(cè)的毛玻璃，不可接觸光學(xué)面。②盛裝溶液時，不能有氣泡或漂浮物，高度為比色皿的3/4。③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干，以保護透光面。三、使用與維護④

測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液潤洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。⑤清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1∶2）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。3）用不同的波長測試時，每改變一次波長，都應(yīng)重新調(diào)100%T。4）在分析工作中，待測溶液的吸光度應(yīng)控制在0.2-0.8。三、使用與維護3、儀器維護（1）儀器對工作環(huán)境的要求穩(wěn)固、溫度15～28℃、干燥、無腐蝕性氣體、光線不宜過強（2）儀器保養(yǎng)和維護方法①電源穩(wěn)定在220V，最好配備穩(wěn)壓器；②光源不用不要開（鎢燈、氘等）；③單色器不能拆開，經(jīng)常更換干燥劑；④正確使用吸收池；⑤光電轉(zhuǎn)換元件不能長時間曝光。四、測定方法（一）工作曲線法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）（二）標(biāo)準(zhǔn)對照法（一）工作曲線法（1）作圖法*方法：配制一系列不同含量的待測組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含待測組分的空白溶液為參比，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。并繪制吸光度-濃度曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線），然后再在相同條件下測定試樣溶液的吸光度。由測得的吸光度在曲線上查得試樣溶液中待測組分的濃度，最后計算得到試樣中待測組分的含量。*標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線）：以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制曲線。（1）作圖法*根據(jù)Lambert-BeerLaw，配制一系列不同含量的待測組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以該物質(zhì)吸收光譜圖中的

max為入射光，以不含待測組分的空白溶液為參比，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。并繪制吸光度-濃度曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線），然后再在相同條件下測定試樣溶液的吸光度。由測得的吸光度在曲線上查得試樣溶液中待測組分的濃度，最后計算得到試樣中待測組分的含量。（一）工作曲線法（一）工作曲線法動畫為消除溶劑或其他有色物質(zhì)對入射光的吸收，消除光在溶液中的散射和比色皿對光的反射等的因素的影響，必須采用空白溶液作對照。測定時，首先將空白溶液置于光路，調(diào)節(jié)儀器的“Zero”鍵，使A=0或T=100%，然后開始測定標(biāo)準(zhǔn)溶液或被測液的A。1.溶劑空白——除被測物以外，其他溶劑均為無色時，可用溶劑作空白溶液。2.試劑空白——顯色劑有色時，按顯色條件加入各種試劑和溶劑，只是不含有被測物的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻兹芤海ㄒ唬┕ぷ髑€法（一）工作曲線法*注意事項:標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)設(shè)定4個以上濃度；標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣溶液的組成保持一致；待測試液的濃度應(yīng)在工作曲線線性范圍內(nèi)，最好在工作曲線中部；工作曲線應(yīng)定期校準(zhǔn)；工作曲線法適于成批樣品的分析，可以消除隨機誤差。（一）工作曲線法（2）計算法工作曲線可用一元線性方程表示：y=a＋bxb為直線斜率a為直線的截距r為相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)r接近1，說明工作曲線線性好，一般要求所作工作曲線的相關(guān)系數(shù)r要大于0.999。（二）標(biāo)準(zhǔn)對照法用一個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液cs，在一定條件下，測得其吸光度As，然后在相同條件下測得試液cx的吸光度Ax：條件：cs與cx濃度應(yīng)接近，且符合吸收定律。

課后思考題1、許多化合物的最大吸收波長常出現(xiàn)在200-400nm。對這一光譜區(qū)間應(yīng)選用的氘燈還是鎢燈？另一種燈又何時選用？2、試述分光光度計的基本結(jié)構(gòu)？實訓(xùn)二

紫外吸收光譜曲線的繪制（2學(xué)時）

實訓(xùn)目的1、掌握紫外-可見分光光度計使用方法及注意事項。2、掌握在不同波長下測定溶液的吸光度及吸收光譜曲線的繪制。實訓(xùn)原理朗伯-比爾定律A=Kbc當(dāng)一束平行單色光垂直入射通過均勻、透明的吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液對光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度的乘積成正比。實訓(xùn)材料1、儀器紫外-可見分光光度計2、材料與試劑牛血清白蛋白、250ml燒杯、50ml燒杯、洗瓶、吸水紙、廢液缸、蒸餾水。實訓(xùn)步驟1、預(yù)熱儀器。接通電源，檢查無擋光物，打開電源（自檢狀態(tài)），預(yù)熱20min（工作狀態(tài)）。2、選擇合適光源。200～370nm選用氘燈，370～800nm選用鎢絲燈。3、選擇測試模式。用“模式”鍵設(shè)置測試方式，根據(jù)需要選擇吸光度（A）、濃度（c）、透射比（T）。4、選擇分析波長。5、放入樣品溶液。將參比溶液（放第一格）和待測溶液（放其它格內(nèi)）放入樣品槽中，蓋上樣品室蓋。實訓(xùn)步驟6、調(diào)零，0ABS/100%T。將參比溶液推入光路。按【0ABS/100%T】鍵，顯示屏顯示為A=0.000/T=100%。調(diào)0%T。打開樣品室蓋，按【0%T】鍵，顯示屏顯示為－0.XXXA。7、測定。將待測溶液推入光路，依次測試待測溶液數(shù)據(jù)，記錄。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。8、關(guān)機。測量完畢，取出吸收池，清洗并倒置在吸水紙上晾干，晾干后入盒保存，切斷電源。整理桌面，罩上儀器防塵罩，填寫儀器使用記錄。注意事項1、為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。2、正確使用比色皿。（1）拿取吸收池時，只能用手指接觸兩側(cè)的毛玻璃，不可接觸光學(xué)面；（2）不能將光學(xué)面與硬物或贓物接觸，只能用擦鏡紙或絲綢擦拭光學(xué)面；（3）盛裝溶液時，不能有氣泡或漂浮物，高度為比色皿的3/4。（4）凡含有腐蝕玻璃的物質(zhì)的溶液，不得長時間盛放在吸收池；（5）吸收池使用后應(yīng)立即用水沖洗干凈；（6）不得在火焰或電爐上進(jìn)行加熱或烘烤吸收池。注意事項④測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液潤洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。⑤清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1∶2）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。3、用不同的波長測試時，每改變一次波長，都應(yīng)重新調(diào)100%T。4、比色皿配套性檢驗：（1）石英比色皿：在220nm處裝蒸餾水；在350nm處裝w（K2Cr2O7）=0.006%K2Cr2O70.001mol·L-1HClO4溶液。以一個吸收池為參比，調(diào)節(jié)τ為100%，測量其他各吸收池的透射比，透射比的偏差小于0.5%的吸收池可配成一套。（2）玻璃比色皿：在600nm處裝蒸餾水；在400nm處裝w（K2Cr2O7）=0.006%K2Cr2O70.001mol·L-1HClO4溶液。注意事項（3）簡便方法：用鉛筆在洗凈的吸收池毛面外壁編號并標(biāo)注光路走向。在吸收池中分別裝入測定用溶劑，以其中

一個為參比，測定其他吸收池的吸光度。若測定的吸光度為零或兩個吸收池吸光度相等，即為配對吸收池。若不相等，可以選出吸光度值最小的吸收池為參比，測定其他吸收池的吸光度，求出修正值。測定樣品時，將待測溶液裝入校正過的吸收池，測量其吸光度，所測得的吸光度減去該吸收池的修正值即為此待測液真正的吸光度。注意事項數(shù)據(jù)處理1、記錄吸光度值2、繪制樣品溶液的吸收光譜曲線，確定入射波長。波長(nm)200220240260270275280285290300320吸光度A

實訓(xùn)三鄰二氮菲分光光度法測定水微量鐵（4學(xué)時）實訓(xùn)目的1、掌握分光光度法測定鐵的操作方法及注意事項。2、掌握用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。實訓(xùn)材料1、儀器可見分光光度計、天平、分析天平。2、材料與試劑50ml容量瓶、10ml吸量管、5ml吸量管、2ml吸量管、1ml吸量管、洗耳球、吸水紙、洗瓶、廢液缸、蒸餾水。濃H2SO4、NH4Fe（SO4）2·12H2O、鹽酸羥胺、95%乙醇、鄰二氮菲（1,10-菲羅林）、醋酸鈉。3、實驗準(zhǔn)備H2SO4溶液（3mol·L－1）、鐵標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg·mL－1）、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg·mL－1）、鹽酸羥胺溶液（100g·L－1）、鄰二氮菲溶液（1.5g·L－1）、醋酸鈉溶液（1.0mol·L－1）實訓(xùn)步驟1、準(zhǔn)備工作（1）清洗容量瓶、移液管及所需要的玻璃器皿；（2）配制鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和其他輔助試劑；（3）開機預(yù)熱20min，并調(diào)試至工作狀態(tài)。2、工作曲線的繪制

取6個50ml容量瓶，各加入10.00μg·mL－1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml，1ml100g·L－1鹽酸羥胺溶液，搖勻。再分別加入2ml1.5g·L－1鄰二氮菲溶液，5ml醋酸鈉溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。放置10min，以空白溶液為參比，在510nm處測定并記錄各溶液吸光度。以鐵含量(μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度對鐵含量的工作曲線。實訓(xùn)步驟3、樣品溶液測定

取3只潔凈50mL容量瓶，分別加入5ml樣品，按步驟2顯色，測量吸光度并記錄。4、結(jié)束工作

測量完畢，關(guān)閉電源，拔下