【豬源大腸桿菌的血清型鑒定及耐藥性監(jiān)測探究9800字（論文）】

豬源大腸桿菌的血清型鑒定及耐藥性監(jiān)測研究眾所周知，我國長期以來一直是世界上出名的豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)國家，因此我國的肉豬養(yǎng)殖市場不斷地發(fā)生增長。從以前的散養(yǎng)戶到當(dāng)前的大規(guī)模集中化養(yǎng)殖。然而由于集中規(guī)模養(yǎng)豬的發(fā)展，養(yǎng)殖的時(shí)候或多或少會出現(xiàn)養(yǎng)豬疾病，這樣豬就無法得到健康的成長，在所有的疾病當(dāng)中，豬源大腸桿菌疾病是養(yǎng)豬場內(nèi)最為常見的，其病情表現(xiàn)得多樣化和復(fù)雜。使得生產(chǎn)性能下落，經(jīng)濟(jì)效益無法增長，然而養(yǎng)豬成本不斷攀升，使得很多養(yǎng)豬專業(yè)戶遭受大量的損失。并且為預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病，抗生素被廣泛應(yīng)用，一些抗生素還被用作動(dòng)物養(yǎng)殖中的促生長發(fā)育飼料添加劑，不正當(dāng)?shù)氖褂脤?dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)菌株對抗菌藥物的抗性快速上升。一方面大腸桿菌血清型種類眾多，難以確定抗原的血清型，造成疫苗免疫的針對性差和有效保護(hù)不足;另一方面多重耐藥菌株的產(chǎn)生又使藥物療效大打折扣導(dǎo)致臨床不能有效防治。為了解本地區(qū)豬場大腸桿菌血清型及菌株耐藥情況，本研究對周邊20個(gè)中小規(guī)模養(yǎng)豬場和屠宰場進(jìn)行病料采集和大腸桿菌分離鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和血清型鑒定，為本地豬場大腸桿菌病防治提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：豬源大腸桿菌；血清型鑒定；耐藥菌株目錄TOC\o"1-4"\h\u87391前言 184911.1研究背景 1177691.2研究目的意義和主要內(nèi)容 1236452豬源大腸桿菌概述 154802.1豬源大腸桿菌概述 155702.2豬源大腸桿菌病的流行病學(xué) 2252722.3大腸桿菌抗原特性 2246982.4抗生素防治研究進(jìn)展 233833豬源大腸桿菌血清型鑒定 3228233.1目的與意義 3292683.2材料 355063.2.1豬血清樣品及病料 3283573.2.2培養(yǎng)基 3117223.2.3材料設(shè)備 458233.3鑒定方法與結(jié)果 557673.3.1細(xì)菌培養(yǎng) 584933.3.2鑒定方法 5300603.3.3血清鑒定結(jié)果 696053.4討論 6129084豬源大腸桿菌耐藥性檢測 623244.1研究的目的與意義 6200184.2材料 782014.3鑒定方法與結(jié)果 745104.3.1藥敏試驗(yàn) 7265044.3.2致病菌大腸桿菌分離鑒定結(jié)果 715294.3.3耐藥性測定結(jié)果 7106274.4討論 8255995豬源大腸桿菌滅活疫苗的制備及免疫保護(hù)效力評價(jià) 882385.1目的與意義 8225065.2試驗(yàn)方法及材料 877545.2.1材料 8110435.2.2方法 8109095.3結(jié)果分析 9103185.3.1滅活苗的研制 9123675.3.2滅活苗的檢驗(yàn) 9298875.3.3免疫保護(hù)試驗(yàn) 9130615.4討論 9129636結(jié)論 911498參考文獻(xiàn) 111前言1.1研究背景隨著生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，豬源大腸桿菌疾病風(fēng)險(xiǎn)也不斷加大，豬源大腸桿菌疾病傳播不斷加快，豬源大腸桿菌疾病致死率不斷上升。豬源大腸桿菌疾病已成為威脅生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、食品質(zhì)量安全、公共衛(wèi)生乃至國家經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的重大問題。豬源大腸桿菌疾病主要有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，仔豬黃痢、仔豬白痢是危害現(xiàn)在豬養(yǎng)殖業(yè)重要傳染病之一，它具有較高的發(fā)病率和死亡率，主要危害1-7d的仔豬，但是感染腸致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)是仔豬黃痢、仔豬白痢的主要原因。仔豬黃白痢又稱早發(fā)性大腸桿菌病，由致病性大腸桿菌引起，一種主要發(fā)生于1-7d仔豬急性、致死性傳染病，該病有高的發(fā)病率(90%-95%)和死亡率（30%），尤其是首胎母豬，發(fā)病率可達(dá)85%以上，其臨床表現(xiàn)為腹瀉、排除黃色水樣糞便和迅速死亡[1]。環(huán)境因素、母豬體質(zhì)和營養(yǎng)水平常常影響仔豬腸道微生物穩(wěn)態(tài)是誘發(fā)仔豬黃痢的重要原因，帶菌母豬和患病仔豬是仔豬黃痢主要傳染源，通常通過污染母豬皮膚、乳頭和環(huán)境，因此初生仔豬吸吮乳頭、接觸母豬皮膚及被感染的食物飲水時(shí)，病原就可以通過仔豬消化道從而導(dǎo)致仔豬黃痢的發(fā)生，因此，該疾病顯著影響仔豬存活率和斷奶重，嚴(yán)重制約生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。豬源大腸桿菌疾病儼然已成為制約生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素，極大的影響著生豬安全生產(chǎn)以及人類健康，因此做好豬源大腸桿菌疾病的防控成為世界各國發(fā)展生豬產(chǎn)業(yè)，穩(wěn)定生豬市場與社會經(jīng)濟(jì)秩序的重要課題。鑒于此原因，本課題于本地區(qū)的養(yǎng)豬場的仔豬進(jìn)行取樣，取樣前對仔豬的體況進(jìn)行檢查，采樣后封存于無菌試管中，隨即送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豬源大腸桿菌疾病病原分離鑒定，明確豬源大腸桿菌疾病的發(fā)病情況，為豬源大腸桿菌疾病的治療和預(yù)防提供有用的理論依據(jù)。1.2研究目的意義和主要內(nèi)容基于致病性大腸桿菌是導(dǎo)致仔豬黃痢、仔豬白痢的重要原因，本文主要對豬源大腸桿菌的血清型鑒定及耐藥性監(jiān)測進(jìn)行研究，旨在了解豬源大腸桿菌疾病的感染狀況，確定本地區(qū)的豬源大腸桿菌疾病主要病原及其分布特點(diǎn)，為制定科學(xué)合理的防治對策提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)針對目前豬源大腸桿菌疾病發(fā)生和流行特點(diǎn)，制定出系統(tǒng)的保健計(jì)劃，確保養(yǎng)豬業(yè)健康、持續(xù)、快速地發(fā)展。為了避免仔豬黃白痢的進(jìn)一步蔓延，及時(shí)采取有效的防控措施，確保仔豬不受病害的危害，使仔豬健康生長，避免豬場的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，為地區(qū)防治該病提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。2豬源大腸桿菌概述2.1豬源大腸桿菌概述大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)俗稱大腸桿菌，屬于埃希菌屬，菌體周生菌毛和鞭毛，部分菌株有微夾膜，大多數(shù)菌株有運(yùn)動(dòng)性。菌株經(jīng)革蘭染色后以油鏡觀察，視野中可見粉紅色短桿菌，大小約為0.4μm~0.7μm×2μm~3μm，是兼性厭氧菌，能在多種培養(yǎng)基中生長，菌落在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長為灰白色，在伊紅美蘭瓊脂平板上生在為藍(lán)紫色且具有金屬光澤，在麥康凱瓊脂平板上生長為粉紅色，可通過菌落在不同培養(yǎng)基上形態(tài)進(jìn)行鑒別和純化。非致病大腸桿菌是腸道正常菌群的組成部分，而致病性大腸桿菌可引起動(dòng)物發(fā)生腹瀉、敗血癥和衰竭等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致動(dòng)物死亡[2]。2.2豬源大腸桿菌病的流行病學(xué)豬大腸桿菌一般為仔豬黃白痢，仔豬黃白痢的致病原因是由大腸桿菌而引起的一種多發(fā)性傳染病。仔豬黃白痢，又稱仔豬大腸桿菌病，這種傳染病致死率比較高，發(fā)病表現(xiàn)為腹瀉、排黃白色或黃色水樣排泄物和快速脫水。1周或者1-3天的仔豬是最常見的。仔豬在同一窩中的發(fā)病率很高，通常在90%以上，死亡率很高，有時(shí)甚至整窩都出現(xiàn)死亡的情況。仔豬白色痢疾又稱延遲性大腸桿菌病。臨床表現(xiàn)為腹瀉、排白乳、黃白色或灰白色痰粘液便。仔豬黃白痢是世界范圍內(nèi)的一種普通病和多發(fā)病，其特點(diǎn)是發(fā)病范圍廣，發(fā)病率較高，耐藥性強(qiáng)和治愈率低[3],大腸桿菌則是引起仔豬黃白痢最重要的病因之一,隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，雖然各種醫(yī)療條件和養(yǎng)殖業(yè)的養(yǎng)殖環(huán)境都在不斷提升，但是國內(nèi)各個(gè)地區(qū)的仔豬黃白痢的發(fā)病率依然沒有明顯下降，隨之而來的是高質(zhì)量豬肉的減少,如何降低仔豬黃白痢的發(fā)病率對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成的巨大的危害，如何降低仔豬黃白痢的發(fā)病率是當(dāng)前亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。近年來，該病嚴(yán)重危害了我國養(yǎng)豬業(yè)。2004年7月至2005年7月，石愛華對遼寧省錦州市34個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)65名農(nóng)民80頭母豬生產(chǎn)的809頭仔豬進(jìn)行了調(diào)查[5]。結(jié)果表明，該病發(fā)生在全鎮(zhèn)調(diào)查。平均發(fā)病率和死亡率分別為20.3%和27.5%，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。申胤生等人報(bào)道，2006年2月至4月，陜西省某大型養(yǎng)豬場16窩仔豬在出生后2-3天死于大量疾病。最后的診斷是由小豬體內(nèi)的大腸桿菌引起的[6]。據(jù)文獻(xiàn)記載，該病主要導(dǎo)致1～30日齡仔豬感染黃、白糞便并迅速死亡。發(fā)病率為90%-95%。頭發(fā)病的發(fā)病率在30-60%之間。死亡率一般在30%左右，其中一些超過80%[7]。它是影響大型養(yǎng)豬場和農(nóng)村散養(yǎng)仔豬成活率的一種重要疾病。因此，對該病的研究對整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，提高農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)水平，促進(jìn)整個(gè)國民經(jīng)濟(jì)的健康有序發(fā)展具有重要意義。2.3大腸桿菌抗原特性大腸桿菌抗原主要有菌體抗原(O),鞭毛抗原(H)及勃附素抗原和莢膜抗原(K)，大腸桿菌一共有抗原有173種，K抗原有80種，H抗原有56種，不同動(dòng)物對大腸桿菌的血清型敏感性不同，豬主要對O8、09、0139等13中血清型敏感，并且由于不同地區(qū)或者不同養(yǎng)殖場的管理不同，導(dǎo)致在不同地區(qū)或者不同養(yǎng)殖場流行的O抗原的血清型有所不同，大腸桿菌的K抗原屬于勃附素，與仔豬腹瀉密切相關(guān)的K抗原包括F4、F5、F6、F41四種，而大腸桿菌的H抗原與仔豬腹瀉關(guān)系較小。2.4抗生素防治研究進(jìn)展抗生素療法是目前針對致病性大腸桿菌的常規(guī)療法，常與補(bǔ)液療法聯(lián)合使用。目前，我國在臨床上普遍使用的抗生素包括β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類?？咕幬锏牟粩鄳?yīng)用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷增加，致使治療效果愈發(fā)不理想。臨床上經(jīng)常使用的廣譜高效抗生素類藥物在抑殺病菌的同時(shí)，也會對動(dòng)物胃腸中正常有益微生物菌群造成損害，致使動(dòng)物機(jī)能紊亂。所以在使用抗生素治療大腸桿菌時(shí)，首先應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用針對性較強(qiáng)的抗生素，并根據(jù)患病動(dòng)物反應(yīng)及時(shí)調(diào)整用藥方案。隨著抗生素的使用，細(xì)菌耐藥性越來越高。楊莉，余波等為了解貴州省豬源大腸桿菌對抗生素耐藥的情況，采集2018—2019年貴州省5個(gè)市縣規(guī)模豬場的糞便和樣品1202份,經(jīng)分離培養(yǎng)和生化鑒定,獲得大腸桿菌532株,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示大部分大腸桿菌分離株對抗生素多重耐藥,這對指導(dǎo)貴州大腸桿菌病防治具有重要的臨床意義。每個(gè)地區(qū)飼養(yǎng)模式、疾病防控、管理水平等差異導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥存在明顯的地域差性和耐藥情況越來越嚴(yán)重，因此有必要進(jìn)行尋找新型的防治藥物和技術(shù)手段。3豬源大腸桿菌血清型鑒定3.1目的與意義豬大腸桿菌疾病是養(yǎng)豬場最為常見和造成經(jīng)濟(jì)損失比較嚴(yán)重的一種腸道疾病，豬大腸桿菌疾病一般為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外對豬大腸桿菌疾病作了大量研究，但是豬大腸桿菌疾病的發(fā)生受到仔豬生活環(huán)境、自身的免疫力和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件的影響，在不同的區(qū)域發(fā)病率有所不同，豬大腸桿菌疾病的發(fā)生大多數(shù)是由病原微生物引起的。為了掌握本地區(qū)豬場大腸桿菌血清型分布和耐藥情況，2020年5月至2021年1月，對本地區(qū)20個(gè)中小規(guī)模養(yǎng)豬場和屠宰場進(jìn)行病料采集和大腸桿菌分離鑒定，并進(jìn)行血清型鑒定，為本地豬場大腸桿菌病防治提供理論支持。3.2材料3.2.1豬血清樣品及病料采自本地區(qū)20個(gè)中小規(guī)模養(yǎng)豬場，共計(jì)200份，均為仔豬。這20個(gè)規(guī)?；i場（編號：A1-A20）飼養(yǎng)規(guī)模在300頭母豬群到800頭母豬群之間，均為一條龍式生產(chǎn)，飼養(yǎng)品種為杜洛克-長白-大白；PRRS，PCVII，MH以及APP均沒有免疫；PR的免疫程序?yàn)榉N豬3-4次年，生長育肥豬在65-70日齡免疫一次，使用的疫苗為進(jìn)口gF一缺失弱毒活疫苗；CSF免疫程序?yàn)榉N豬2次/年，仔豬在25和65日齡免疫2次，使用兔化弱毒細(xì)胞苗。3.2.2培養(yǎng)基表3-1培養(yǎng)基、試劑、儀器及生產(chǎn)廠家培養(yǎng)基及試劑名稱生產(chǎn)廠家普通肉湯培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司科技有限公司瓊脂肉湯培養(yǎng)基上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司鮮血瓊脂平板購自寶生物工程(大連)有限公司河南比根生物科技有限公司4SGreen核酸染料上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司胰蛋白胨大豆瓊脂青島海博生物技術(shù)有限公司葡萄糖杭州天和微生物試劑有限公司甘露醇杭州天和微生物試劑有限公司微量生化發(fā)酵管杭州天和微生物試劑有限公司麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)科技有限公司西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂北京奧博星生物技術(shù)有限公司伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）北京奧博星生物技術(shù)有限公司馬鈴薯葡萄糖瓊脂青島高科園海博生物技術(shù)有限公司厭氧菌瓊脂青島高科園海博生物技術(shù)有限公司三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）北京奧博星生物技術(shù)有限公司甘露醇發(fā)酵青島高科園海博生物有限公司5%綿羊血瓊脂平板青島高科園海博生物有限公司血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基青島高科園海博生物技術(shù)有限公司磷酸鹽緩沖稀釋液青島高科園海博生物技術(shù)有限公司抗生素藥敏片上海士鋒生物科技有限公司MH肉湯青島高科園海博生物技術(shù)有限公司革蘭氏陽性菌鑒定板河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供革蘭氏陰性菌鑒定板（GNID）河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供普通肉湯培養(yǎng)基制作：稱取牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、NaCl5g、K2HPO41g、蒸餾水1000ml，將上述物質(zhì)混合搖勻后加熱溶解，以0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整酸堿度至pH7.4～7.6，用濾紙過濾后分裝，置高壓鍋內(nèi)121℃滅菌15～30min備用。7.5%NaCl營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制作：在普通肉湯培養(yǎng)基制作的基礎(chǔ)上，將肉湯中NaCl含量增加，配制為7.5%NaCl營養(yǎng)培養(yǎng)基。普通瓊脂培養(yǎng)基制作：將瓊脂按500ml肉湯內(nèi)加10g的比例加熱煮沸，瓊脂完全溶化后調(diào)pH至7.4～7.6，再加熱20min，用紗布夾脫脂棉過濾、高壓滅菌制成斜面或平皿待用。5%鮮血瓊脂培養(yǎng)基：將滅菌后的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，降溫至50℃左右，加入5%無菌脫纖綿羊或家兔鮮血，混合均勻后，分裝入滅菌試管或平皿。待凝固后，置37℃培養(yǎng)24h，檢驗(yàn)無菌后即可使用。3.2.3材料設(shè)備試驗(yàn)過程中所用試驗(yàn)儀器和試劑耗材見表3-2所示。表3-2試驗(yàn)儀器和試劑耗材儀器名稱Apparatus型號Model購買廠家或地址CompanyorAddtess無菌操作臺HD-850上海勝衛(wèi)電子科技有限公司臺式高速離心機(jī)H2-16KR上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司Eppendorf移液器系列1000μL,200μL,100μL,20μL10μL,2.5μL德國臺式溫床振蕩器IS-RSD3蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司PCR儀SelectCyclerII上海巴玖電子天平FA系列上海丙林電子科技有限公司凝膠成像儀KodakDC120美國超低溫冰箱DW-86L338海爾三恒電泳儀EPC3000上海超凈工作臺CJ-2D天津泰斯特電熱恒溫水浴鍋21-6江蘇常熟冰箱BCD-257SL美的紫外分光光度計(jì)CintraGBC公司全溫振蕩培養(yǎng)箱TS-2102GZ常州高德儀器制造有限公智能水浴恒溫振蕩器ZYS-300A黑龍江東拓儀器制造有限公司超低溫冷凍儲存器DW-HL3958中科美菱低溫科技股份有限公司奧林巴斯顯微鏡CKX53日本立式壓力蒸氣滅菌器LDZH-200KBS上海申安分析天平BA600－4麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG－9033B5上海新苗醫(yī)療器械電熱恒溫培養(yǎng)箱LDZM中科美菱低溫科技股份有限公司3.3鑒定方法與結(jié)果3.3.1細(xì)菌培養(yǎng)在病原菌分離培養(yǎng)前，先將樣本充分混合均勻，嚴(yán)格無菌操作，將樣本分別接種于普通瓊脂斜面、普通肉湯和5%鮮血瓊脂斜面，置37℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)增殖24h，觀察培養(yǎng)物生長情況和菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行記錄。對菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色后鏡檢，根據(jù)培養(yǎng)物鏡檢結(jié)果，選擇特征性菌落接種血瓊脂和普通瓊脂、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，置恒溫箱72h重新培養(yǎng)，用于細(xì)菌鑒定和PCR分子鑒定。3.3.2鑒定方法3.3.2.1病原菌培養(yǎng)和鏡檢鑒定培養(yǎng)到一定時(shí)間后，觀察培養(yǎng)基上有沒有菌落生長，如果有，再進(jìn)行觀察細(xì)菌生長的菌落形態(tài)、大小、規(guī)則度、顏色等。鏈球菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良或不生長，在5%鮮血瓊脂上生長為細(xì)小光滑、扁平或突起、邊緣整齊白色菌落，進(jìn)行記錄。肉湯接種培養(yǎng)后，觀察肉湯透明度、渾濁程度、是否管底有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附著物，是否出現(xiàn)菌臘膜、菌環(huán)等。在肉湯中除乳房鏈球菌使肉湯一致混濁外，無乳、停乳鏈球菌在管底形成絮狀沉淀。腸桿菌在肉湯中呈均勻混濁，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌環(huán)。然后進(jìn)行記錄。除此之外，對于培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行涂片染色鏡檢，初步來鑒別細(xì)菌類別，顯微鏡下來觀察細(xì)菌形態(tài)特征，根據(jù)病原菌大小、形態(tài)、有無莢膜、芽孢等特征進(jìn)行細(xì)菌初步鑒定。3.3.2.2病原菌的生化鑒定把純化培養(yǎng)基的病原菌分別進(jìn)行IMViC試驗(yàn)，包括吲哚、甲基紅(MR)、VP及枸櫞酸鹽利用等試驗(yàn)，進(jìn)一步進(jìn)行三糖鐵斜面培養(yǎng)，觀察試驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄，目的是用于確定純化培養(yǎng)基中的細(xì)菌是否為大腸桿菌，觀察并記錄結(jié)果。表3-3大腸桿菌和克雷伯氏菌培養(yǎng)基生長特征名稱生長特征血液瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基大腸桿菌菌落生長較好，灰黃色，表面光滑濕潤，有時(shí)出現(xiàn)β-溶血現(xiàn)象。生長較好，粉紅色不透明，放置后菌落顏色開始由紅變白。克雷伯氏菌菌落生長旺盛，色黃，表面呈隆起，光滑濕潤。生長特別旺盛，2-3mm，高度隆起，粉紅色不透明，放置后菌落轉(zhuǎn)白。表3-4大腸桿菌的生化鑒定指標(biāo)菌名三糖鐵脲酶枸櫞酸鹽MR葡萄糖甘露醇吲哚VP乳糖阿拉伯糖大腸桿菌克雷伯氏菌–––––+++±+++–±±–++++將鑒定后的菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，用0.5%石碳酸生理鹽水2mL沖洗細(xì)菌菌落，收集密封在5mL玻璃瓶內(nèi)并用生理鹽水稀釋至1×1010CFU/mL，121℃高壓滅菌2h，作為待檢抗原備用。移液槍吸取O抗原單因子血清1滴到玻片上，再取1滴待檢抗原加入血清，立即混勻，靜置5min后觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)凝集則為陽性。以待測抗原和生理鹽水混合液作為空白對照，排除細(xì)菌自凝現(xiàn)象。3.3.3血清鑒定結(jié)果所有420份血清樣本檢測總結(jié)果顯示，PRV的陽性率為6.2%（26/420）。各豬場及各生長階段豬群檢測結(jié)果如下：43株分離菌中的35株分屬6種血清型，優(yōu)勢血清型為O149、O20、O141、O8、O137、O87,血清型的菌株占已鑒定菌株的94%。另有6株未能定型，占分離菌株的18.6%,詳見表3-5。表3-5樣本檢測血清型情況血清型O149O20O141O8O137O87菌株數(shù)864351來源豬場數(shù)6421313.4討論對43份大腸桿菌進(jìn)行血清定型實(shí)驗(yàn)，共有6種。而且本地區(qū)內(nèi)各個(gè)豬場之間亦有所不同，同一豬場可存在多個(gè)血清型。且血清型十分復(fù)雜，這與豬場不斷從外地引進(jìn)種豬更新豬群，以及這些菌株的變異性和更迭性等有密切關(guān)系。而且，各豬場不同時(shí)期流行的血清型也不盡相同。因此，在防治本病時(shí)應(yīng)充分注意，必須定期對豬場的大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，選擇疫苗時(shí)應(yīng)與本地流行血清型相對應(yīng)，選用針對性較強(qiáng)的菌株制苗進(jìn)行免疫，有條件的豬場應(yīng)進(jìn)行血清型的診斷或采用本地(場)菌株制造滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。4豬源大腸桿菌耐藥性檢測4.1研究的目的與意義大腸桿菌容易接受其他細(xì)菌的耐藥基因或在抗生素壓力下產(chǎn)生耐藥性，可通過多種遺傳因素將耐藥基因轉(zhuǎn)移到敏感菌株，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的傳播，提高細(xì)菌耐藥性會導(dǎo)致細(xì)菌性動(dòng)物疾病不能用常用藥物治愈，而被迫增加抗生素的劑量或使用更多的抗生素，進(jìn)一步促進(jìn)耐藥性的增長，從而造成惡性循環(huán)。4.2材料病料來自于本地區(qū)4個(gè)區(qū)縣共計(jì)420份樣本，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原微生物的分離鑒定和分子鑒定（PCR法）。試驗(yàn)過程中所用試驗(yàn)儀器和試劑耗材見表3-1、3-2所示。4.3鑒定方法與結(jié)果4.3.1藥敏試驗(yàn)在分離培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)皿中，加入1ml生理鹽水，用無菌接種環(huán)刮取培養(yǎng)基表面菌落，使之盡可能多地進(jìn)入生理鹽水中。取硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)比濁管，與菌液比濁，用生理鹽水稀釋菌液到標(biāo)準(zhǔn)濁度。用1ml滅菌吸管吸取細(xì)菌懸液，在90mm平皿培養(yǎng)基內(nèi)加入約0.4ml，用涂菌棒涂勻。靜置5min，待菌懸液稍干后，沿平皿邊緣（距皿壁約1cm）均勻貼上藥敏紙片。每個(gè)平皿內(nèi)貼5個(gè)，將平皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10h后取出，用卡尺測量每個(gè)藥敏片的抑菌范圍即抑菌圈直徑，并記錄。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)M100來判斷致病菌對各種抗生素的耐藥程度，抑菌范圍d≥20mm以上為高度敏感，15mm＜d＜19mm范圍為中間；d≤14mm為耐藥。4.3.2致病菌大腸桿菌分離鑒定結(jié)果致病菌大腸桿菌分離鑒定共計(jì)420份樣本進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，病料接種麥康凱平板，在71份樣本中分離到48株菌落呈圓形、中等大小的磚紅色疑似大腸桿菌的菌株。將48株紅色菌落中的細(xì)菌分別進(jìn)行生化試驗(yàn)，有3株產(chǎn)H2S(YJX3，CYQ9，F(xiàn)MQ6)，1株VP試驗(yàn)和構(gòu)椽酸鹽利用試驗(yàn)為陽性(PSS9)，1株MR試驗(yàn)和JIA試驗(yàn)為陰性，予以剔除，其它菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸。各菌株均不產(chǎn)生HzS。根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，鑒定出大腸桿菌43株。4.3.3耐藥性測定結(jié)果結(jié)果表明，所分離到的大腸桿菌對硫酸鏈霉素、頭孢噻肟、氧氟沙星、先鋒靈針劑、乳酸諾氟沙星和復(fù)方新諾明比較敏感，但對壯觀霉素和磺胺嘧啶鈉都產(chǎn)生耐藥性，不同的致病菌對不同的藥物敏感度有所不同。表4-1致病菌耐藥試驗(yàn)結(jié)果抗生素名稱藥敏片含量（μg/片）大腸桿菌阿米卡星30S硫酸鏈霉素10I頭孢噻肟30S恩諾沙星5R氧氟沙星5S林可霉素2I慶大霉素10I壯觀霉素10R硫酸卡那霉素30S磺胺嘧啶鈉250R先鋒靈針劑30S四環(huán)素30R鹽酸環(huán)丙沙星5S乳酸諾氟沙星2I克林霉素2I鹽酸土霉素30R復(fù)方新諾明100S頭孢曲松30S注：S代表敏感（抑菌環(huán)在?20mm），I代表中介（抑菌環(huán)15mm＜d＜19mm），R代表耐藥（抑菌環(huán)d＜14mm）4.4討論在藥敏耐藥性試驗(yàn)中可知，不同的地區(qū)和不同規(guī)模的養(yǎng)豬場分離出的細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，有的抗生素敏感度很高，這可能是由于本試驗(yàn)調(diào)查的養(yǎng)豬場條件不同，治療方面所用抗生素種類也有所不同，所以，分離出的致病菌中都有不同程度的耐藥性，試驗(yàn)結(jié)果與國內(nèi)有關(guān)報(bào)道基本吻合。5豬源大腸桿菌滅活疫苗的制備及免疫保護(hù)效力評價(jià)5.1目的與意義盡管抗生素對仔豬黃痢具有較好的防治效果，但是隨著抗生素的濫用導(dǎo)致大腸桿菌具有較高的耐藥性；因此針對當(dāng)?shù)貎?yōu)勢大腸桿菌血清型自制相應(yīng)的滅活苗進(jìn)行產(chǎn)期母豬免疫可有效預(yù)防仔豬黃痢的發(fā)生，從而保證仔豬的健康生長。5.2試驗(yàn)方法及材料5.2.1材料試驗(yàn)菌株、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、福爾馬林、妊娠母豬杜洛克(由本地區(qū)某養(yǎng)豬場提)。5.2.2方法5.2.2.1滅活苗的研制將血清型菌株接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，在37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，再用無菌生理鹽水輕輕沖洗。將洗滌后的培養(yǎng)物收集并包裝在滅菌瓶中。用Macintosh比濁法測定各血清型菌株的細(xì)菌數(shù)。根據(jù)細(xì)菌數(shù)量，加入不同量的無菌正常鹽水，使其含有細(xì)菌總數(shù)，然后在細(xì)菌稀釋液中加入體積為0.4%的福爾馬林，輕輕搖動(dòng)，于37℃條件下滅活，48h后包裝密封。5.2.2.2滅活苗的檢驗(yàn)取適量的滅活苗，采用妊娠母豬安全性進(jìn)行檢查：選擇10頭產(chǎn)前15d左右的妊娠母豬，皮下注射4ml滅活苗，試驗(yàn)期為一周，觀察妊娠母豬的采食、生長狀態(tài)、流產(chǎn)情況及產(chǎn)后新生仔豬的生長情況等。5.2.2.3免疫保護(hù)試驗(yàn)滅活苗對妊娠母豬免疫保護(hù)的影響選擇10頭產(chǎn)前15d左右的妊娠母豬，皮下注射2ml的滅活苗，待妊娠母豬產(chǎn)子后，選擇10頭體重相近的仔豬，采用滅活前的混合細(xì)菌懸液(2ml)對相應(yīng)的仔豬進(jìn)行攻毒，試驗(yàn)期為一周，觀察仔豬斷奶期內(nèi)的生長情況，并記錄仔豬發(fā)生黃痢的頭數(shù)和死亡情況，測定其對仔豬的保護(hù)率。5.3結(jié)果分析5.3.1滅活苗的研制將滅活苗接種于普通瓊脂或麥康凱瓊脂平板上后通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上無任何微生物生長。5.3.2滅活苗的檢驗(yàn)采用妊娠母豬對滅活苗的安全性進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)，在注射一周后，妊娠母豬無異常反應(yīng)，健康狀況良好，采食正常，無流產(chǎn)等現(xiàn)象，滅活苗注射未對母豬、胎兒及新生仔豬無負(fù)面影響。5.3.3免疫保護(hù)試驗(yàn)采用滅活苗進(jìn)行免疫后，使仔豬黃白痢的發(fā)生率降至10.98%，單因素方差分析結(jié)果表明滅活苗對仔豬黃白痢有顯著的的預(yù)防效果。5.4討論豬大腸桿菌優(yōu)勢血清型制備滅活疫苗，該滅活苗對母豬、胎兒及新生仔豬沒有負(fù)面影響；并且能顯著降低豬大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率，滅活苗免疫對仔豬具有顯著的保護(hù)作用。6結(jié)論本文對本地區(qū)養(yǎng)豬場進(jìn)行調(diào)查，從細(xì)菌分離鑒定試驗(yàn)中，我們可以得出在71份樣本中分離到48株菌落呈圓形、中等大小的磚紅色疑似大腸桿菌的菌株。從各豬場血清檢測結(jié)果來看，所有420份血清樣本檢測總結(jié)果顯示，PRV的陽性率為6.2%（26/420）。各豬場及各生長階段豬群檢測結(jié)果如下：43株分離菌中的35株分屬6種血清型，優(yōu)勢血清型為O149、O20、O141、O8、O137、O87,血清型的菌株占已鑒定菌株的94%。另有6株未能定型，占分離菌株的18.6%。并且420份樣本進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)表明，不同的菌株對抗生素均有一定的耐藥性?；谝陨蟽?nèi)容的分析，得出早期斷奶仔豬腹瀉的原因很多，也是現(xiàn)階段早期斷奶仔豬常見的問題。如未能加以有效的防治，則可能使仔豬走向死亡，并且給養(yǎng)殖戶帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失。對于仔豬黃白痢病的防治，本文提出以下幾點(diǎn)建議:一是合理設(shè)置生產(chǎn)用房，做好生產(chǎn)用房消毒工作，及時(shí)清理生產(chǎn)用房，保證生產(chǎn)用房的清潔衛(wèi)生。建立健全豬場生物安全體系，以衛(wèi)生清潔消毒為中心，將消毒衛(wèi)生工作貫穿于豬場生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。其次，加強(qiáng)母豬的產(chǎn)期管理，增強(qiáng)母豬的抗病能力，預(yù)防疾病的發(fā)生。斷奶后仔豬免疫力增強(qiáng)，飼料粗蛋白水平逐漸提高。參考文獻(xiàn)BelaN,PeterZF.2005.EnterotoxigenicEscherichiacoliinveterinarymedicine.InternationalJournalofMedicalMicrobiology,295:443~454.單玉平,朱國強(qiáng),李鋒,等.連云港市規(guī)模